МІКРОБІОЛОГІЯ - М.Г. Сергійчук - 2008

Розділ 2. МОРФОЛОГІЯ І БУДОВА БАКТЕРІАЛЬНОЇ КЛІТИНИ

Методи мікроскопічного дослідження мікроорганізмів

Основним інструментом для вивчення будови бактеріальної клітини є мікроскоп. Світловий мікроскоп - це складний оптичний прилад, призначений для вивчення дрібних предметів, організмів і структур тканин, тобто таких об'єктів, яких не видно неозброєним оком. Сучасний мікроскоп забезпечує можливість вивчати об'єкти в променях світла, що проходить крізь систему лінз та об'єкт, проводити фазово- контрастну, люмінесцентну, інтерференційно-поляризаційну та інші види мікроскопічних досліджень.

Основними елементами конструкції світлових мікроскопів є механічна й оптична частини та система освітлення (рис. 2.1).

Рис. 2.1. Мікроскоп з бінокулярною насадкою і дзеркалом:

1 - окуляри; 2 - бінокулярна насадка; 3 - револьвер; 4 - об'єктив; 5 - предметний столик; 6 - конденсор; 7 - дзеркало; 8 - гвинт для переміщення кронштейна кондесора; 9 - механізм точного фокусування; 10 - механізм грубого фокусування; 11 - тубусотримач; 12 - гвинт для закріплення насадки

Сучасні об'єктиви - це багатолінзові системи (рис. 2.2), від якості яких залежить зображення об'єкта. Порядок розташування лінз в об'єктивах такий, що лише маленька лінза, звернута до об'єкта (так звана фронтальна лінза), дає дійсне збільшення. Усі інші лінзи є корекційними, вони корегують аберації, які мають місце в оптичних приладах. Чим сильніший об'єктив, тим меншу фокусну відстань має його фронтальна лінза, а тому зі зростанням збільшувальної здатності вона набуває все більш сферичної форми. Чим менша фронтальна лінза, тим вища збільшувальна здатність об'єктива.

Рис. 2.2. Об'єктив, який складається з 10 лінз

Одним із недоліків оптичних систем є аберація. Розрізняють хроматичну та сферичну аберацію. При хроматичній аберації зображення, яке створюється зеленими променями, не збігається із зображенням, яке створюється червоними й синіми променями. У результаті утворюється зафарбоване зображення безбарвного об'єкта. Сферична абераціясупроводжується тим, що точка предмета проектується не у вигляді точки, а у вигляді кола більшого чи меншого діаметра. При цьому зображення розпливається, стає нечітким, оскільки поле зору викривляється й неможливо бачити одночасно центр і краї зображення предмета.

Основні характеристики об’єктива - збільшення й апертура. Від апертури об’єктива залежить роздільна здатність оптичного мікроскопа. Апертура (А - числова апертура) об'єктива - це синус половини апертурного кута (sin α/2) при вершині конуса світлового потоку, який проходить через об’єкт (рис. 2.3): A = sin α /2 .

Рис. 2.3. Схема ходу променів при різній величині кута u:

А - об'єкт; О - об'єктив; α - апертурний кут ; u - половина апертурного кута

Таке рівняння буде правильним, якщо між об’єктом і фронтальною лінзою об’єктива знаходиться повітря (п = 1). Для збільшення апертури об’єктива запропоновано заповнювати простір між фронтальною лінзою

об'єктива і об'єктом речовиною, яка має n > 1, тоді: A = n sin α/2. Ці речовини називають імерсійними. Уперше їх запропонував Джованні Амічі в 1840 р. Останніми роками виготовляють об'єктиви, які потребують різних імерсійних середовищ (табл. 2.1).

Таблиця 2.1. Показники заломлення різних середовищ

Окуляр складається, як правило, з двох лінз: одна з них направлена до об'єкта, а друга - до ока. Вибір окулярів для роботи залежить від типу об'єктива, який використовується в роботі. Окуляри відрізняються за збільшенням та будовою.

Система освітлення оптичного мікроскопа складається з конденсора, дзеркала та джерела світла. Вона призначена для найкращого освітлення препарату. Конденсор закріплений над дзеркалом і складається з декількох лінз. Він збирає паралельні промені, відбиті дзеркалом від джерела світла в одній точці - фокусі, який має міститися в площині препарату. Конденсор разом з оправою може вертикально переміщатися в межах 20 мм за допомогою спеціального гвинта. Дзеркало, увігнуте з одного боку і плоске з іншого, закріплене в основі штатива. Під час роботи з конденсором, який розрахований на фокусування паралельних пучків світла, користуються лише плоскою стороною. Увігнуте дзеркало використовують у тих випадках, коли працюють без конденсора. У цьому разі дзеркало збирає пучок паралельних променів, які йдуть від джерела світла, і фокусує його в площині препарату.

У більшості сучасних мікроскопів система освітлення є частиною самого мікроскопа.

Роздільна здатність оптичного мікроскопа - це та найменша відстань між двома крапками (чи рисками), за якою вони спостерігаються роздільно (не зливаються). Ця характеристика залежить від числової апертури об'єктива (А₁), освітлювальної системи (А₂) мікроскопа та довжини хвилі світла (λ):

Довжина хвилі світла, яке сприймається оком людини, становить 0,4-0,7 мкм (середнє значення λ - 0,55 мкм).

З рівняння видно, що роздільна здатність мікроскопа збільшується зі зменшенням довжини хвилі світла, яке використовується для освітлення об'єкта, і збільшенням числової апертури об'єктива та освітлювальної системи.

Найменшу довжину хвилі мають ультрафіолетові промені - вона в них удвічі менша, ніж у денного світла. Базуючись на цьому, P. Келер і Р. Рор сконструювали мікроскоп для ультрафіолетових променів. Оскільки звичайне скло майже не пропускає таких променів (λ - 0,4 мкм), лінзи мікроскопа довелось виготовляти з кварцу і флюориту. Невидиме для ока зображення сприймається при цьому на фотографічну пластинку.

Інша ідея лежить в основі ультрамікроскопа Жигмонді й Зідентопфа. Відомо, що найдрібніші пилинки в повітрі можна розглянути, якщо пропустити в темній кімнаті боковий промінь світла крізь невеликий отвір. Виходячи з цих спостережень, вони застосували принцип потужного бічного освітлення в темному просторі. Завдяки такому освітленню на темному фоні препарату чітко видно яскраво освітлені контури об'єкта. Роздільна здатність при цьому збільшується на один і більше порядків.

При зменшенні довжини хвилі світла зменшуються порушення в дрібних структурах об'єкта, які визначаються дифракційними явищами.

Збільшення апертури об'єктива дозволяє збирати промені, які розсіюються під великим кутом, дрібними деталями об'єкта.

Таким чином, роздільну здатність мікроскопа можна посилити шляхом зменшення довжини хвилі світла, яке проходить крізь мікроскоп (використання синіх світлофільтрів), і збільшення апертури оптичної системи.

Загальне збільшення мікроскопа (V) визначається добутком збільшення об'єктива (V_об.) на збільшення окуляра (V_ок): V = V_об · V_ок . Якщо об'єктив дає збільшення 100^х, а окуляр - 15^х, то загальне збільшення становить 1500. Для повного використання роздільної здатності мікроскопа і найкращого розглядання об'єкта необхідно використати оптимальне сполучення об'єктива й окуляра, яке дає так зване корисне збільшення. Установлено, що корисне збільшення мікроскопа не може перевищувати числову апертуру об'єктива більш як у 1000 разів. Виходячи з корисного збільшення, підбирають окуляр, який оптимально відповідає даному об'єктиву.

У цілому, коли йдеться про мікроскопію у світлому полі, то роздільна здатність сучасного оптичного мікроскопа становить 0,2 мкм.

В основі методу мікроскопії в темному полі лежить явище Тіндаля - освітлення об'єкта косими високоапертурними бічними променями світла. Це досягається використанням спеціальних параболоїд- конденсорів, конденсорів темного поля або звичайного конденсора Аббе із затемненою центральною частиною. У таких конденсорах центральна частина паралельного пучка променів затримується і не потрапляє в об'єктив. Поле зору залишається неосвітленим, темним. Бічні промені, проходячи крізь кільцеву щілину конденсора, розташовану між його центральною частиною й краєм, потрапляють на бічну поверхню лінзи, відбиваються від неї, направляються під кутом у площину препарату і фокусуються на ньому. Якщо на шляху косого відбитка променя нема ніяких частинок, то він, заломлюючись, виходить за межі площини препарату, не потрапляючи в об'єктив (рис. 2.4). Поле зору залишається темним.

Рис. 2.4. Хід променів при мікроскопії в темному полі:

об. - об'єктив; п. - покривне скло; п.с. - предметне скло; о. і. - олійна імерсія; д.т. - діафрагма темного поля; л.к. - лінза конденсора

Якщо в препараті містяться які-небудь частинки (об'єкти), то косі промені, відбиті конденсором, зустрічаються з цими частинками і заломлюються на них, утворюючи хвилі дифрагованого світла. Ці дифраговані промені поширюються під кутом у різних напрямках, і частина їх потрапляє в об'єктив. Як результат - на темному фоні поля зору видно частинки, які яскраво світяться.

Для дослідження в темному полі препарат готують за методом "роздавленої краплі» (товщина предметного скла має бути не більше 1,1 мм, а покривного - 0,17 мм).

Мікроскопія в темному полі належить до ультрамікроскопічних методів, оскільки має більшу роздільну здатність (до 0,06-0,02 мкм). Вона дозволяє спостерігати за рухом мікробних клітин, виявляти збудників деяких захворювань (лептоспірозів), вивчати мікроорганізми, розміри яких лежать за межами роздільної здатності світлового мікроскопа. Проте в темному полі зору неможливо добре вивчити форму клітини, особливо ж її внутрішню будову.

Фазово-контрастна мікроскопія. Око людини розрізняє тільки довжину (колір) і амплітуду (інтенсивність, контрастність) світлової хвилі, але не сприймає різниці у фазі.

Майже всі живі клітини прозорі, оскільки промені світла, проходячи крізь них, не змінюють своєї амплітуди. Але відомо, що контрастність зображення прямолінійно залежить від ступеня поглинання світла різними структурними елементами об'єкта. Якщо в об'єкті чергуються ділянки, які сильно й слабо поглинають світло, то воно, проходячи крізь різні ділянки такого об'єкта, буде різним. Перетворити "фазовий" (неконтрастний) препарат в "амплітудний" (контрастний) можна шляхом забарвлювання об'єкта (для живих клітин цей спосіб малопридатний) або зниження апертури конденсора, для чого прикривають його діафрагму, що знижує роздільну здатність мікроскопа.

Метод фазово-контрастної мікроскопії розроблений для спостереження за прозорими об'єктами. Він базується на перетворенні за допомогою певного оптичного пристрою фазових змін, які мають місце при проходженні світлової хвилі крізь об'єкт, у видимі амплітудні (рис. 2.5).

Рис. 2.5. Хід променів у фазово-контрастному мікроскопі

Якщо в об'єктив звичайного мікроскопа вмонтувати спеціальний диск - фазову пластинку з кільцем (її отримують шляхом напилення диска солями рідких металів завтовшки в декілька десятих мікрометрів), а в конденсор - кільцеву діафрагму (непроникну для променів світла пластинку з прозорою щілиною у вигляді кільця) так, щоб крізь конденсор і об'єктив проходило лише кільце світла, яке потім суміщають з кільцем фазової пластинки об'єктива, то фази світла, що проходить, зсуваються (як правило, на 1/4 довжини хвилі), фазові зміни переходять в амплітудні, а препарат стає контрастним. Прозорі у світлому полі зору препарати стають різко контрастними на світлому фоні (позитивний фазовий контраст) або блискучими на темному фоні (негативний фазовий контраст).

Промінь світла, який потрапляє на прозорий об'єкт, розщеплюється на два промені - прямий і дифрагований. Прямий промінь А (див. рис. 2.5) йде з кільцевої діафрагми, проходить крізь частинки об'єкта і фокусується на кільці фазової пластинки. Дифрагований промінь Б, проходячи крізь об'єкт, не потрапляє на фазову пластинку. Оптичні шляхи цих двох променів різні. Між ними створюється різниця фаз, і неозброєним оком це зміщення не сприймається. Фазовою ж пластинкою ці фазові зміни перетворюються в амплітудні, які сприймаються оком.

Фазово-контрастна мікроскопія не збільшує роздільної здатності оптичної системи мікроскопа, але вона дозволяє розглядати тонкі структури живих клітин мікроорганізмів, вивчати стадії їх розвитку і процес поділу клітини, виявляти вплив хімічних речовин на мікробну клітину, вимірювати її прижиттєві розміри.

Люмінесцентна мікроскопія. Ідея Ернста Аббе про можливість використання ультрафіолетових променів з метою підвищення роздільної здатності мікроскопу була реалізована в 1904 р. співробітниками фірми "Карл Цейсс" Р. Келером і М. Рором при конструюванні люмінесцентного мікроскопа. Зображення в люмінесцентному мікроскопі виникає за рахунок світіння (люмінесценції) досліджуваного об'єкта при його освітленні короткохвильовими (λ=300-460 нм) променями.

Люмінесценцією називають явище світіння збуджених систем, тобто систем, що утворюються внаслідок поглинання атомами речовин, які входять до неї, різних видів енергії. Залежно від виду енергії, яка поглинається, розрізняють термо-, хемі-, електро- і фотолюмінесценцію.

Фотолюмінесценцією називають люмінесценцію, яка виникає після попереднього поглинання квантів світлового випромінювання. Частинка починає інтенсивно світитися в результаті поглинання квантів збуджуючого світла. Повертаючись до вихідного стану, система віддає отриману енергію у вигляді світла, довжина хвилі якого більша за довжину хвилі збуджуючого випромінювання.

Енергія квантів випромінювання обернено пропорційна довжині хвилі, тому кванти збуджуючого випромінювання завжди містять більше енергії, ніж кванти люмінесцентного світіння.

При феномені люмінесценції проходить певний проміжок часу між поглинанням збуджуючої енергії та емісією люмінесцентного світіння. Якщо цей проміжок часу перевищує 10^-4с, то таке явище називається фосфоресценцією·, світіння, яке виникає за коротший проміжок часу, має назву флюоресценції. Світіння самої речовини об'єкта, опроміненого ультрафіолетовими променями, називають первинною флюоресценцією, або аутофлюоресценцією (власною флюоресценцією). Якщо ж світіння виникає в спеціальній субстанції (у так званих флюорохромах), якою насичений досліджуваний об'єкт, його називають вторинною флюоресценцією. При флюоресценції об'єкти, наприклад клітини, наче світяться на темному фоні поля зору мікроскопа.

Препарати, оброблені флюорохромами, випромінюють у середовищах, які не виявляють люмінесценції під дією короткохвильових променів, таких як вода, гліцерин, вазелінова олія або фізіологічний розчин.

Люмінесцентна мікроскопія дозволяє спостерігати об'єкти, розміри яких перебувають за межами роздільної здатності оптичного мікроскопа. Крім того, вона дає можливість вивчати зміни окремих структур клітини при різних функціональних станах.

Електронна мікроскопія. Одним із суттєвих досягнень прикладної фізики ХХ ст. є створення електронного мікроскопу, яке привело до перевороту в уявленні вчених про біологічні структури. Принцип електронної мікроскопії полягає в тому, що електромагнітне поле впливає на пучок електронів аналогічно до того, як скляна лінза впливає на промінь світла. Електронний промінь характеризується властивостями електромагнітного випромінювання з дуже малою довжиною хвилі. Якщо електрони прискорені в електричному полі з напругою 100 кВ, то довжина хвилі буде лише 0,04 нм, тобто приблизно в 10 000 разів менше, ніж у видимого світла. Відповідно і роздільна здатність електронного мікроскопу на декілька порядків вища, ніж у світлопольного (див. рівняння визначення роздільної здатності оптичного мікроскопу).

Шлях електронів у трансмісивному (просвічуючому) електронному мікроскопі подібний до шляху променів видимого світла у світловому мікроскопі. Пучок електронів, що виходить з електронної пушки, проходить через ряд електромагнітних лінз. Конденсорна лінза збирає пучок електронів на препараті, а декілька збільшувальних лінз створюють збільшене зображення, яке проектується на екран. Оскільки

повітря перешкоджало б руху електронів, весь шлях електронного пучка відбувається у високому вакуумі. Через низьку здатність проникнення електронів в електронному мікроскопі досліджують лише ультратонкі зрізи товщиною до 100 нм.

У трансмісійному електронному мікроскопі контраст зумовлюється тим, що електрони по-різному розсіюються на різних ділянках препарату, причому ефективність розсіювання залежить від кількості атомів та 'їхньої маси. Оскільки до складу біологічних матеріалів входять переважно атоми з невеликою масою, то контрастність таких матеріалів невелика. Її підвищують за допомогою напилення солями важких металів.

Як світловий, так і електронний трансмісивний мікроскоп дає плоске зображення. Модифікований електронний мікроскоп (скануючий) дозволяє отримувати тривимірне зображення поверхні досліджуваних об'єктів. У такому мікроскопі об'єкт, покритий тонким шаром важкого металу, сканується вузьким пучком електронів (електронним зондом) подібно до того, як це відбувається в телевізійній трубці. Електрони, що надходять від тієї точки об'єкта, на яку потрапляє скануючий пучок, збираються колектором і за допомогою підсилювача створюється зображення на екрані електронно-променевої трубки. Контраст зумовлений тим, що кількість відбитих об'єктом вторинних електронів пропорційна куту між електронним пучком і поверхнею об'єкта, що дозволяє виявити його просторову структуру.