ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ - В. А. Галынкин - 2015

ЧАСТЬ II. АНТИМИКРОБНЫЕ АГЕНТЫ

ГЛАВА 20. ИММУНОПРЕПАРАТЫ: ПРОИЗВОДСТВО И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

Основные достижения иммунологии, связанные с практическим использованием научных результатов, направлены на профилактику и лечение инфекционных и неинфекционных заболеваний. Иммунопрепараты, особенно вакцины, в этом отношении оказываются значительно полезнее, чем какие-либо фармацевтические продукты.

Вакцинация против оспы, бешенства, сибирской язвы, дифтерии, полиомиелита, коклюша, кори, столбняка, анаэробной инфекции и др. привела к резкому сокращению этих заболеваний. Методы иммунологии и использование иммунопрепаратов необходимы при решении проблем переливания крови, трансплантации органов, резус-гемолитической болезни новорожденных, для диагностики и терапии многих заболеваний.

20.1 Вакцины

Вакцины — это препараты, содержащие антигены одного или нескольких возбудителей инфекционных заболеваний, и предназначенные для создания искусственного активного иммунитета с целью профилактики и лечения соответствующего заболевания. Термин предложил Пастер в честь Дженнера, который в 1796 г. показал, что прививки коровьей оспы — вакцинация (vaccina — коровья) — эффективна для профилактики натуральной оспы. Вакцина Дженнера — гениальное эмпирическое достижение; развитие иммунологии инфекционных болезней как науки, основанной на знании их этиологии, начинается с открытия Пастера, доказавшего возможность ослабления вирулентности возбудителей с сохранением их иммунологических свойств и создавшего вакцину против бешенства и сибирской язвы. Это открытие послужило основой для разработки живых вакцин, содержащих микроорганизмы с ослабленной вирулентностью (аттенуированные). В настоящее время существуют разнообразные вакцинные препараты, которые будут рассмотрены ниже.

Живые вакцины готовят из аттенуированных штаммов микроорганизмов, которые получают в основном путем селекции спонтанных мутантов с ослабленной вирулентностью. Для этого микроорганизмы длительное время культивируют в неблагоприятных для них условиях или пассируют на невосприимчивых животных. Например, для получения вакцинного штамма BCG (Bacillus Calmette, Guerin) Mycobacterium tuberculosis пассировали 13 лет (230 пересевов) на среде с желчью. Антирабическая (против бешенства) вакцина была получена Пастером путем многократного (113 пассажей) пассирования инфекционного агента на кроликах до получения так называемого фиксированного вируса, т. е. вируса с определенным значением вирулентной для кролика дозы и безопасного для человека.

Используют также вакцинные штаммы, полученные путем индуцированных мутаций или генетических рекомбинаций. Такие штаммы требуют длительного контроля ввиду опасности реверсии к исходному вирулентному типу.

Живые вакцины используют для профилактики бактериальных (сибирская язва, туляремия, бруцеллез, туберкулез, чума, сыпной тиф, желтая лихорадка) и вирусных (бешенство, полиомиелит, корь, оспа, грипп, паротит) инфекций.

Убитые вакцины получают из клеток высокоиммуногенных штаммов, инактивированных физическим (нагревание, ультрафиолетовые лучи) или химическим (фенол, этанол, ацетон, формальдегид) методами. Их используют для профилактики бактериальных (брюшной тиф, коклюш, холера, лептоспирозы, синегнойная инфекция) и вирусных (клещевой энцефалит, бешенство, грипп) инфекций. Для лечения хронических заболеваний используют вакцины из убитых бактерий, выделенных от больного (стафилококков, гонококков, шигелл, бруцелл и др.).

Химические вакцины готовят из антигенных фракций микробных клеток. Примерами бактериальных химических вакцин могут служить брюшнотифозная вакцина, содержащая гликоконъюгаты клеточных стенок Salmonella spp., капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis и др. Вирусные химические вакцины (против гриппа, герпеса, ящура, клещевого энцефалита, бешенства и др.) содержат компоненты поверхностных структур капсида.

Преимуществом химических вакцин является относительно низкое содержание балластных веществ, высокая стабильность, малая реактогенность и возможность побочного действия. Отсутствие нуклеиновых кислот исключает опасность реверсии к данному типу, потенциально существующую у живых вакцин. Недостаток таких вакцин — более низкая иммуногенность по сравнению с корпускулярными (содержащими клетки) вакцинами из-за быстрого выведения антигена из организма. Для пролонгирования действия их вводят с адъювантами — веществами, усиливающими иммунный ответ (табл. 42).

Таблица 42. Адъюванты

Анатоксины — это обезвреженные, но сохраняющие иммуногенность экзотоксины возбудителей столбняка, дифтерии, анаэробной инфекции, ботулизма, холеры, стафилококковый и др.

Рибосомалъные вакцины обладают высокой протективной активностью при сравнительно низкой токсичности и низкой типоспецифичностью, что оказывается практически ценным, т. к. позволяет получить протективные вакцины широкого спектра действия (против многих сероваров одного вида или даже против нескольких видов одного рода микроорганизмов). Практическое применение находит рибосомальная поливакцина против заболеваний; вызванных видами Klebsiella, Streptococcus, Staphylococcus, Proteus и Haemophilus influenzae.

Генно-инженерные вакцины получают с использованием рекомбинантных клеток. Примером такой вакцины служит препарат, содержащий полипептидный HBs антиген вируса гепатита В. Ген, кодирующий HBs-антиген, клонирован в дрожжевых клетках, которые синтезируют белок, обладающий протективной активностью. Существенным достоинством таких вакцин является безопасность, поскольку их изготовление не требует контакта с возбудителями заболеваний.

Синтетические вакцины разрабатывают с учетом знания структуры антигенных детерминант возбудителя определенного заболевания, необходимых для создания иммунитета. Их достоинствами являются химическая чистота и безопасность. Примером такой вакцины может служить препарат, содержащий синтетический аналог протеина клеточной мембраны малярийного плазмодия. Этот протеин обеспечивает контакт плазмодия с оболочкой эритроцита, образующиеся к нему антитела препятствуют проникновению возбудителя в эритроциты хозяина.

ДНК-вакцины разрабатываются на основе плазмид, содержащих участки вирусной ДНК. В клетках иммунизированного животного такие плазмиды индуцируют экспрессию антигенов вируса, на которые развивается иммунный ответ. Такие вакцины пока не нашли практического применения ввиду потенциальной опасности злокачественной трансформации клеток организма с участием вакцинной ДНК.

Антиидиотипические вакцины создают на основе антиидиотипических антител (АИА). Идиотип иммуноглобулина определяется особенностями структуры его активного центра, от которых зависит его антигенная специфичность. Структура гипервариабельной области молекулы иммуноглобулина является отражением структуры определенной антигенной детерминанты (например, микробного антигена). Иммунизация животных специфическими иммуноглобулинами (идиотипами) позволяет получить АИА, которые, отражая структуру идиотипа, являются зеркальным отображением микробного антигена или «внутренним образом антигена». Таким образом, АИА — это вакцины без антигена. Их разрабатывают против возбудителей, имеющих большое количество перекрестно реагирующих антигенов, или с трудом поддающихся культивированию (вирусы гепатита В, бешенства, грибов и др.).

Ассоциированные вакцины содержат антигены различного происхождения. Например, вакцина АКДС включает убитые клетки возбудителя коклюша, дифтерийный и столбнячный анатоксины.

Этапы получения вакцин включают выбор штамма, разработку условий его хранения и культивирования, подготовку посевного материала, накопление биомассы клеток в специальных биореакторах (ферментаторах), отделение микробных клеток от культуральной среды и последующую их обработку. Необходимым этапом является стандартизация вакцин и контроль их качества.

Бактерии культивируют на питательных средах, состав которых обеспечивает накопление достаточного количества биомассы с сохранением иммуногенной активности и антигенной специфичности штамма.

Вакцинные штаммы вирусов выращивают на эмбрионах птиц (кур, уток, перепелок) и на культивируемых клетках человека и животных. Клетки получают из ткани (например, почек эмбриона человека или обезьяны) диспергированной трипсином. Суспензию клеток помещают в специальную среду, где они размножаются, образуя монослой на плоской поверхности сосуда (первичную культуру). Вторичная культура может быть получена путем перенесения клеток первичной культуры в свежую питательную среду. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед. Перевиваемые линии клеток способны к многократному субкультивированию, они представлены различными линиями трансформированных, например, опухолевых клеток. Химические вакцины получают путем разрушения бактериальных клеток и (или) экстракцией антигенных компонентов с последующей их очисткой соответствующими физико-химическими методами. Анатоксины получают из культурального фильтрата, обезвреженного формалином (0,4% формалина, 38°C, 21-25 дней) с последующей очисткой. Рибосомы выделяют из клеток, разрушенных механическим способом или обработкой ультразвуком, методом ультрацентрифугирования. Вакцинный препарат содержит рибосомы нескольких видов микроорганизмов и пептидогликан Klebsiella pneumoniae в качестве адъюванта

Контроль качества вакцинных препаратов осуществляют на всех стадиях их изготовления, включая контроль готовой лекарственной формы, в строгом соответствии с утвержденной нормативно-технической документацией. В процессе изготовления контролируют отсутствие посторонних микроорганизмов и сохранение свойств (иммуногенность, токсигенность) вакцинной культуры. При контроле готовых препаратов оценивают: растворимость и гомогенность (для сухой вакцины при добавлении растворителя); стерильность (методом посева на питательные среды); безвредность (пробой на животных); иммуногенность (вакциной иммунизируют чувствительных животных, после этого их заражают смертельной дозой возбудителя данного заболевания; процент выживших животных указывает на степень иммуногенности); переносимость каждой серии вакцины проводят на группе добровольцев из 5 человек, оценивают их общее состояние и местную реакцию; правильность этикетирования и упаковки.

Активность анатоксина определяют по его способности реагировать со специфической антитоксической сывороткой в реакции флоккуляции.

Вирусные вакцины проверяют не только на отсутствие бактерий и грибов, но и посторонних вирусов, поскольку производственные культуры могут быть заражены разными микроорганизмами, в том числе и онкогенными вирусами. Контролируют культуры тканей и питательные среды, предназначенные для накопления вирусного материала. Сбор вируса испытывают на идентичность и определяют титр вируса.

20.2 Иммуноглобулины

Иммуноглобулины применяют для создания искусственного пассивного иммунитета как для лечения, так и для экстренной профилактики инфекционных заболеваний, особенно у лиц с иммунодефицитами, кроме того, их используют в диагностических целях для определения антигена неизвестного происхождения.

Иммуноглобулины выделяют из сыворотки или плазмы крови доноров или иммунизированных животных. Плазма — это растворимая фракция крови, не содержащая клеток (эритроцитов, лейкоцитов); сыворотка — это растворимая фракция, которая образуется после свертывания крови.

Нормальные иммуноглобулины (g-глобулин, поливалентные иммуноглобулины), содержащие антитела различной специфичности, выделяют из плазмы неиммунизированных доноров и сыворотки плацентарной крови. Основным активным компонентом нормальных иммуноглобулинов является IgG, присутствуют также небольшие количества IgM и IgA. Каждую серию препарата нормальных иммуноглобулинов изготавливают из смеси плазмы, полученной от большого количества доноров (не менее 5000 человек), что нивелирует индивидуальные различия в содержании антител и обеспечивает стандартность иммунологической активности. Препарат содержит широкий набор антител против возбудителей бактериальных и вирусных инфекций (гепатита, кори, коклюша, полиомиелита, гриппа и др.). Кровь донора собирают в стерильные емкости из полимерного материала, содержащие раствор антикоагулянта (5%-ный раствор натрия цитрата) для предотвращения свертывания крови. Клетки крови отделяют центрифугированием и возвращают донору, что значительно снижает возможность неблагоприятных для него последствий. Иммуноглобулины выделяют из плазмы фракционированным осаждением этанолом при температуре ниже 0°C для предотвращения денатурации белка, лиофильно высушивают, разводят до концентрации 10%, стерилизуют методом фильтрации и ампулируют. В связи с тем, что требования к препаратам иммуноглобулинов для внутривенного введения существенно возросли, в их производстве используют усовершенствованные технологии: частичное расщепление протеолитическими ферментами, восстановление, алкилирование, дополнительные этапы хроматографической очистки и др.

Все препараты иммуноглобулинов контролируют на стерильность, апирогенность, содержание белка и безвредность.

Специфические иммуноглобулины выделяют из плазмы или сыворотки крови иммунизированных доноров-добровольцев или животных. Например, противогриппозный иммуноглобулин — из крови доноров, иммунизированных живой гриппозной вакциной; антистафилококковый — из крови доноров, прошедших курс иммунизации стафилококковым анатоксином, или плацентарной крови женщин, иммунизированных в период беременности с профилактической целью.

Для получения некоторых антитоксических и противовирусных иммуноглобулинов (против столбняка, ботулизма, дифтерии, анаэробной инфекции, бешенства, кори, энцефалита и др.) животных (лошадей, овец, коз и др.) многократно иммунизируют возрастающими дозами соответствующего вакцинного препарата. После достижения достаточного титра антител у них берут кровь и из сыворотки выделяют иммуноглобулины по схеме, описанной выше.

Моноклональные антитела. Антитела, присутствующие в плазме крови, образованы многими клонами антителообразующих клеток и, являясь поликлональными, представляют собою гетерогенную группу иммуноглобулинов. Разнообразие поликлональных антител невоспроизводимо, что осложняет стандартизацию препаратов иммуноглобулинов, применяющихся для диагностики, профилактики и лечения соответствующих заболеваний. Наивысшей стандартностью и специфичностью обладают моноклональные антитела, которые вырабатываются одним клоном клеток и поэтому идентичны по антигенной специфичности, а также по классу и типу тяжелых и легких цепей в молекуле. Обычные антителообразующие клетки не способны длительно сохраняться в условиях in vitro. Поэтому в качестве продуцентов моноклональных антител используют гибридные клетки (гибридомы), которые получают путем слияния клеток, продуцирующих антитела на определенный антиген, и миеломных клеток, способных к неограниченному росту in vitro. Миелома — род злокачественной опухоли, образующейся при разрастании плазматических клеток, синтезирующих строго идентичные молекулы иммуноглобулинов неизвестной специфичности. Для гибридизации используют полученные путем мутагенеза клетки миеломы, имеющие маркерные признаки, позволяющие на специальных средах отделить гибридные клетки от родительских. Плазматические клетки, синтезирующие антитела, получают из селезенки иммунизированных мышей. Слияние проводят в среде с полиэтиленгликолем, отбор гибридом — на селективных средах; отбирают клетки, продуцирующие антитела нужной специфичности. Их культивируют на специальных средах, обеспечивающих рост клеток и продукцию антител.

Моноклональные антитела — уникальные по своей специфичности реагенты, используют при изучении сложных молекулярных структур, рецепторов и поверхностных маркеров клеток, в аффинной хроматографии для выделения и очистки веществ и клеток. Кроме того, они могут быть использованы для радиологической диагностики локализации опухолей. Для этого получают антитела против антигена опухоли и конъюгируют их с радиоактивным изотопом. Противоопухолевые антитела, конъюгированные с лекарственным агентом, могут быт полезными при иммунотерапии рака.

Иммуноглобулины могут быть использованы не только с целью терапии и профилактики инфекционных заболеваний, но и в качестве иммунокорригирующих агентов.

Антилимфоцитарные иммуноглобулины блокируют рецепторы цитокинов на поверхности лимфоцитов. Их применяют для снижения количества лимфоцитов при иммунном ответе на трансплантанты. Выделяют из сыворотки крови лошадей, иммунизированных лимфоцитами человека.

Анти-резус иммуноглобулины (фракция IgG антител против резус (Rh)-антигенов эритроцитов человека) используют для предотвращения гемолитической болезни новорожденных при резус-конфликте; получают из плазмы или сыворотки крови резус-отрицательных женщин-доноров.

Моноклональные антитела против рецепторов (CD3, CD4) лимфоцитов и против ИЛ-2 предназначены для избирательного подавления отдельных реакций иммунитета путем блокады рецепторов или подавления функций цитокинов; их получают методами гибридомной технологии.

20.3 Биологически активные пептиды

Фактор переноса — низкомолекулярный нуклеопептид, стимулирует клеточную систему иммунитета, применяется при заболеваниях, связанных с ослаблением иммунитета. Его получают из лейкоцитов крови доноров с выраженной реакцией гиперчувствительности замедленного типа на определенный антиген.

Миелопептиды вырабатываются клетками костного мозга, стимулируют процесс кроветворения, активность Т-лимфоцитов, образование антител. Применяются при патологических состояниях, связанных с нарушением иммунитета, например, при остеомиелите.

20.4 Гормоны

Гормоны тимуса — тимолин, тактивин, тимозин выделяют из вилочковой железы крупного рогатого скота, применяют при ослаблении иммунной системы после облучения, при лечении язв и воспалений, вирусных и бактериальных инфекций. Препараты, аналогичные тимусным пептидам, получают методом химического синтеза (тимулин, тимопентин, тимоген).

Гормон поджелудочной железы — инсулин регулирует углеводный обмен, стимулирует клеточную систему иммунитета. Его выделяют из поджелудочной железы крупного рогатого скота или свиней либо получают методами генетической инженерии, используя в качестве продуцента рекомбинантные штаммы Saccharomyces spp.

Гормон коры надпочечников — глюкокортикостероиды, кортизон и гидрокортизон и их синтетические аналоги предназон и преднизолон относятся к иммуносупрессирующим препаратам, их используют для подавления активности лимфоидных клеток при воспалении, аллергии, трансплантации, лечении аутоиммунных заболеваний.

20.5 Иммуномодуляторы

Иммуномодуляторы — это природные или синтетические препараты, способные оказывать регулирующее действие на функции иммунной системы; кроме того, их влияние распространяется на другие системы организма: сосудистую, нервную, эндокринную, кроветворную.

Иммуномодуляторы синтезируются клетками организма (цитокины, гормоны, биологически активные пептиды), их также получают путем биосинтеза или химического синтеза и применяют в качестве лечебных и профилактических средств при различных заболеваниях и трансплантации.

Интерлейкины получают, используя в качестве продуцентов культуры нормальных лимфоцитов или макрофагов, культуры Т-клеточных гибридов и рекомбинантные клетки микроорганизмов. Т-клеточные гибридомы — это продукты слияния Т-лимфоцитов, продуцирующих определенный интерлейкин, и опухолевых клеток, способных к неограниченному росту. В качестве рекомбинантных продуцентов используют Е. coli, Saccharomyces сегеvisiae и другие микроорганизмы, в геном которых методами генетической инженерии введены гены, контролирующие синтез интерлейкина (ИЛ-1, ИЛ-2).

Среди цитокинов ранее всего в медицинскую практику вошли препараты интерферона, которые используют при вирусных (см. гл. 8) и некоторых злокачественных заболеваниях.

Интерфероны (ИФН) — это группа белков и гликопротеинов, каждый из которых синтезируется определенными клетками организма и выполняет специфические функции. Известно около 20 природных ИФН, различающихся по структуре и биологическим свойствам: α-ИФН состоит из 12 подвидов, β-ИФН — из 3-4 подвидов, γ-ИФН — из 2-3 подвидов. Рекомбинантные ИФН также имеют разновидности.

Продуцентом α-ИФН являются лейкоциты периферической крови человека, которые культивируют на специальной среде в присутствии вируса — интерфероногена. Нативный ИФН выделяют из культуральной жидкости осаждением и хроматографией. Метод имеет ограниченное применение из- за необходимости использования большего количества донорской крови.

α-ИФН синтезируется в культуре фибробластов (клеток соединительной ткани человека) в присутствии в качестве интерфероногена двухцепочечной РНК. γ-ИФН — в культуре иммунных Т- или В-лимфоцитов, в том и другом случае с низким выходом, поэтому производство с использованием культур клеток человека — процесс дорогостоящий. Экономически оправдано получение ИФН с использованием рекомбинантных культур микроорганизмов: Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae. Очистку ИФН проводят методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител.

Колониестимулирующие факторы (КСФ) — это разновидность цитокинов с преимущественным действием на гемпоэз, служат факторами выживаемости и роста кроветворных предшественников. Рекомбинантные препараты КСФ (лейкомакс, молграстим, лейкоген, ленограстим) используют для нормализации подавленного гемопоэза и активации иммунной системы, в частности, на фоне цитотоксической терапии опухолей и индуцированной иммунодепрессии при трансплантации.

20.6 Иммуномодуляторы микробного происхождения

Продигиозан, сальмазан, пирогенал — липополисахариды клеточных стенок Serratia marcescens и Salmonella spp., стимулируют фагоцитоз, активность лимфоцитов, образование антител и интерферона.

Мурамил-дипептид — компонент пептидогликана клеточной стенки бактерий, является активатором макрофагов; его синтетический аналог — ликопид (N-ацетилмурамилаланил-D-изогутамин).

Полисахариды грибов-β-гликаны Saccharomyces spp. (зимозан), Schizophyllum commune (шизофиллан), Lentinula edodas (лентинан), сульфатированный внеклеточный маннанRhodotorula rubra (ронасан), внеклеточный глюкан Aureobasidium pullulans (аубазидан) стимулируют фагоцитоз, активируют иммунокомпетентные клетки, в результате чего повышаютсопротивляемость организма к инфекционным и неинфекционным заболеваниям.

Препараты на основе нуклеиновых кислот получают из дрожжей и других микроорганизмов. Нуклеинат натрия — гидролизат дрожжевой РНК оказывает универсальное иммуномодулирующее действие, эффективен при различных заболеваниях, его основной мишенью являются макрофаги.

Вакцинные препараты могут вызывать не только специфический иммунный ответ, но и оказывать иммуномодулирующее и терапевтическое действие. Например, вакцину BCG применяют не только для профилактики туберкулеза, но и в качестве неспецифического стимулятора клеточного иммунитета при опухолевых заболеваниях.

Антибиотики актиномицин, циклоспорин обладают иммуносупрессирующими свойствами. Последний применяют для подавления иммунного ответа при трансплантации.

20.7 Синтетические иммуномодуляторы

Иммуномодулирующим действием обладают многие аналоги нуклеиновых кислот (синтетические полинуклеотиды), адаптогены, поверхностноактивные вещества (полисульфаты, поликарбонаты), производные пирана, имидазола, флуоренов, пиримидинов и др. Из большого количества иммуномодуляторов только некоторые находят практическое применение, а большая часть не используется из-за их высокой токсичности, стоимости, побочных эффектов и т. п.

Иммуностимуляторы левамизол, дибазол, хлоридин, метилурацил и др. используют при снижении функции иммунной системы, например, в результате радиоактивного облучения, химиотерапии опухолевых заболеваний, вирусных и других инфекций. Иммуносупрессоры: циклофосфан, хлорамбуцил, меркаптопурин и др. применяют для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний и в трансплантологии.

20.8 Диагностические препараты

Методы диагностики многих заболеваний основаны на серодиагностике (serum — сыворотка) — установлении титра антител в сыворотке крови больного с помощью диагностического антигенного препарата или обнаружении антигенов возбудителя инфекции или антигенов опухолевых клеток в тканях организма с помощью антител. Для этих целей используют разнообразные серологические реакции (агглютинации, преципитации, связывания комплемента), иммуноферментный и радиоиммунный анализ и др.

В качестве диагностических препаратов на основе антигенов, применяют вакцинные штаммы микроорганизмов, антигенные фракции, выделенные из клеток возбудителя или полученные методами генетической инженерии. Диагностикумы на основе антител представляют собою поликлональные или моноклональные иммуноглобулины против соответствующего антигена. Чувствительность методов, основанных на использовании моноклональных антител, во много раз превосходит чувствительность реакций с поликлональными антителами.