ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ - В. А. Галынкин - 2015

ЧАСТЬ III. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА

ГЛАВА 21. ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ И ЕЕ СВЯЗЬ С ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТЬЮ

21.1 Нормальная микробиота человека

В условиях физиологической нормы организм человека содержит сотни видов микроорганизмов, среди которых доминируют бактерии, тогда как вирусы и простейшие представлены значительно меньшим числом видов [37, 39]. Подавляющая часть таких микроорганизмов является сапротрофами-комменсалами и не наносит хозяину видимого вреда. Также, как и в окружающей среде, в организме человека микробы существуют в виде биоценозов. Суммарно в биоценозе человека обитает 10 ¹⁴-10 ¹⁵ клеток микроорганизмов, представленных более чем 500 видами, причем некоторые из них остаются до сих пор неизученными. Каждому индивидууму свойственны определенные микробные сообщества, сформировавшиеся в процессе его жизнедеятельности.

Термин «нормальная микробиота» объединяет виды, часто выделяемые из организма здорового человека (табл. 43). Информация о качественном и количественном составе микробиоты здорового человека является очень важной для фармацевтов и биотехнологов, так как человек — постоянный участник производственных процессов и источник возможного поступления туда микроорганизмов. На состав микробиоты разных биотопов (topos — место) влияет состояние гормональной, иммунной, нервной и других систем макроорганизма. Значительную роль в изменении состава микробных ассоциаций играют особенности питания, нерациональная лекарственная терапия, наличие соматических (неинфекционных) заболеваний и условия труда [40].

Таблица 43. Представители нормальной микробиоты человека и частота их выделения

++++ — выделяют практически всегда.

+++ — обычно выделяют.

++ — выделяют часто.

+ — выделяют иногда

Органы и ткани, не соприкасающиеся с внешней средой, свободны от микроорганизмов. В норме стерильными являются сердце, кровь, лимфа, мозг, спинномозговая и синовиальная жидкости, мочевой пузырь, матка, а также глубокие ткани. Основные отделы организма, заселяемые бактериями, включают кожные покровы, верхние дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт и мочеполовую систему.

21.2 Микробиота кожных покровов

Случайная микробиота может быть многочисленной и разнообразной и включает условно-патогенные и патогенные микроорганизмы, попадающие из других биотопов собственного тела или из окружающей среды, которые быстро погибают за счет бактерицидных свойств кожи, сальных секретов и антагонистических взаимоотношений с нормальной микробиотой.

Постоянными представителями являются Staphylococcus epidermidis, St. saprophyticus, микрококки (сарцины), дифтероиды. Место постоянного обитания — роговой слой кожи, протоки сальных желез, волосяные мешочки. Микробиота волосяного покрова имеет идентичный состав. Обычно на 1 см² выявляют 10³-10⁴ микроорганизмов, но на участках с повышенной влажностью это число может достигать 10⁶. У некоторых людей на коже обнаруживают стрептококки, грамположительные спорообразующие палочки.

Стрептококки требовательны к питательным средам, нуждаются во введении специальных добавок (факторов роста); при культивировании их выявляют на среде с добавлением эритроцитарной массы животных (барана). По реакции с гемоглобином стрептококки подразделяют на 3 группы:

α-стрептококки (зеленящие) растут на среде в виде колоний, окруженных зеленоватыми зонами, цвет колоний серовато-зеленоватый;

β-стрептококки дают колонии, окруженные прозрачными зонами за счет лизиса эритроцитов;

γ-стрептококки не вызывают гемолиза эритроцитов.

Стрептококки можно рассматривать как транзиторно-циркулирующие виды (непостоянные).

Наибольшее число микроорганизмов обитает в складках кожи, здесь встречаются грибы рода Candida. В зонах скопления сальных желез (наружное ухо, гениталии) обнаруживают непатогенные кислотоустойчивые микобактерии, коринебактерии, липофильные дрожжи.

На коже волосистой части головы (на скальпе) часто присутствуют Pityrospornm ovalae (на безволосой — P. orbicularae), из дерматофитов обнаруживают виды родов Epidermophyton, Microsporum, Trichophyton. В числе постоянных обитателей кожи у 5-10% здоровых людей встречается St. aureus.

21.3 Микробиота полости рта

В этом биотопе микробиота особенно разнообразна, чему способствуют наличие влаги и питательных веществ, слабощелочные значения pH. Многие условно-патогенные микроорганизмы из состава нормальной микробиоты играют существенную роль в возникновении кариеса, заболеваний пародонта и слизистой оболочки рта. Наличие в полости рта слюны с ее бактерицидными компонентами, лизоцимом, иммуноглобулинами, некоторыми литическими ферментами ограничивают возможности оральных микробов как возбудителей заболеваний. Среди микроорганизмов полости рта встречаются аутохтонные (присущие данному биотопу) и аллохтонные виды — иммигранты из других биотопов (носоглотки, кишечника).

Среди бактерий доминируют стрептококки — 3060% от общего количества микроорганизмов. Чаще всего это зеленящие маловирулентные стрептококки, обладающие определенным тропизмом: Str. mitior — к эпителию щек, Str. salivarius — к сосочкам языка, Str. mutans, Str. sanguis — к поверхности зубов. Они ферментируют углеводы и образуют перекиси. Сдвиг pH в кислую сторону приводит к декальцинированию зубной эмали. Важной является способность синтезировать полисахариды из сахарозы. Глюкозная часть молекулы превращается в декстран (α-1,6-глюкан), а фруктоза — в фруктан (леван). Нерастворимый декстран способствует образованию зубных «бляшек», с помощью которых происходит прикрепление микробных клеток к ткани зуба. Фруктан может служить субстратом в дальнейших процессах кислотообразования даже при отсутствии поступления углеводов извне.

Среди других грамположительных кокков встречаются пептококки, обладающие слабой сахаролитической активностью, но разлагающие пептон и аминокислоты. Чаще всего пептококки встречаются в ассоциациях с фузобактериями и спирохетами при кариесе, пульпите, пародонтите.

Грамотрицательные анаэробные кокки представлены родом Veilonella, они не утилизируют дисахариды, но разлагают пируват, лактат, ацетат до углекислого газа и воды, способствуя повышению pH и сдерживая рост возбудителей кариеса, образующих молочную кислоту. Наибольшее количество молочной кислоты образуют грамположительные палочки рода Lactobacillus. Грамотрицательные микроорганизмы представлены в полости рта родами Bacteroides, Fusobacterium, Leptotrichia. Они ферментируют сахара до СО₂, а пептоны — с образованием продуктов, имеющих неприятный запах.

Бактероиды обладают ферментами коллагеназой и гиалуронидазой, разрушающими ткани, и участвуют в развитии заболеваний пародонта. Фузобактерии — палочки веретенообразной формы обитают в десневых карманах в ассоциации со спирохетами.

Лептотрихии имеют вид попарно расположенных «зернистых» палочек, часто нитевидной формы.

Строму «зубного камня» составляют актиномицеты, они входят в состав зубного налета, принимают участие в образовании зубных бляшек и развитии кариеса.

Коринебактерии способны понижать окислительно-восстановительный потенциал, что способствует росту анаэробов.

Микроорганизмы полости рта способны проникать в кровь, например, после экстракции зуба или даже при чистке зубов.

Спирохеты полости рта представлены родами Treponema (T denticola, T. orale), Borrelia (B. buccalis); Leptospira; простейшие — родами Entamoeba (E. buccalis, E. dentalis) и Trichomonas (T buccalis); из микоплазм часто встречаются Mycoplasma orale, M. salivarium.

21.4 Микробиота верхних дыхательных путей (ВДП)

Верхние отделы ДП несут особенно высокую микробную нагрузку, так как они анатомически приспособлены для осаждения бактерий из вдыхаемого воздуха.

В полости носа обнаруживают негемолитические и зеленящие стрептококки, непатогенные грамотрицательные кокки — нейссерии, стафилококки, корине- бактерии. У некоторых людей постоянно встречается золотистый стафилококк, т. е. наблюдается резидентное носительство.

В гортани находят негемолитические и α-гемолитические стрептококки, у 100% людей обнаруживается негемолитический вариант Str. pyogenes, негемолитические стафилококки, дифтероиды. В тканях миндалин — микоплазмы и аденовирусы.

Мелкие бронхи, альвеолы, паренхима легких свободны от микроорганизмов.

21.5 Микробиота желудочнокишечного тракта (ЖКТ)

Микробиота ЖКТ различается по качественному и количественному составу в зависимости от его отдела. В желудке здорового человека за счет низких значений pH содержится 10³-10⁴ кл/мл содержимого, в основном, кислотоустойчивые микроорганизмы: лактобациллы, Helicobacter pylori, дрожжи, при патологии в результате повышения pH их количество возрастает.

В верхних отделах тонкой кишки обнаруживается 10⁴-10⁵ кл/мл, по качественному составу это молочнокислые микроорганизмы, отличающиеся по адгезивности от тех, что находятся в полости рта и желудка, а также бифидобактерии и фекальные энтерококки. Площадь слизистой оболочки тонкого кишечника составляет 180-200 м². Через нее в кровь постоянно всасываются разнообразные вещества, в том числе микробного происхождения, возможно попадание и самих микробных клеток даже у здорового человека, не говоря о патологических состояниях.

Микробиота толстого кишечника наиболее многочисленна и разнообразна. Количество микробов достигает 10⁹-10¹¹ кл/мл (иногда 10¹² кл/мл) принадлежащих к 260 видам. Численно превалируют анаэробы: бифидобактерии, бактероиды, лактобациллы, вейлонеллы, пептококки, клостридии. Факультативно-анаэробные микроорганизмы представлены бактериями группы кишечной палочки (БГКП), фекальными энтерококками.

Группа кишечной палочки объединяет бактерии 4 родов семейства Enterobacteriaceae: Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella. Объединение этих микроорганизмов в группу кишечной палочки произведено на основании общих признаков: это грамотрицательные, неспорообразующие, оксидазоотрицательные палочки, ферментирующие глюкозу и лактозу до кислоты и газа при 37°C за 24 часа.

БГКП (преимущественно Escherichia coli) занимают по численности второе место после бифидобактерий, на третьем месте по численности энтерококки: Enterococcus faecalis и E. faecium. Значительно меньше клостридий: Clostridium perfringens и C. sporogenes.

В кишечнике живут также кишечная амеба (Entamoeba coli), кишечные вирусы, у некоторых людей — дрожжеподобные грибы рода Candida.

21.6 Микробиота мочеполовой системы

Состав микробиоты этих биотопов различается в зависимости от пола, возраста и органа. Почки, мочеточники, моча в мочевом пузыре не содержат микроорганизмов. В нижней части уретры встречаются неспорообразующие анаэробы: пептококки, пептострептококки, бактероиды, микобактерии и грамотрицательные бактерии кишечного происхождения. Микробиота влагалища формируется с наступлением половой зрелости. Это молочнокислые бактерии (палочки Додерлайна), коринебактерии, негемолитические стрептококки, дрожжеподобные грибы и простейшие, для которых благоприятна кислая среда этого органа (pH 4,0-4,2).

21.7 Значение нормальной микробиоты

Нормальная микробиота здорового человека играет важную роль в поддержании здоровья и в нормальном функционировании всего организма. Большинство микроорганизмов, живущих в разных биотопах, обладает антагонистическими свойствами по отношению к другим, в частности, патогенным бактериям и вирусам. Например, бифидобактерии и лактобациллы выделяют кислоты (молочную, уксусную), спирты, лизоцим, бактериоцины, могут активно тормозить развитие гнилостных бактерий в кишечнике, ингибируют выделение энтеропатогенными эшерихиями термолабильного токсина.

Важным механизмом подавления роста патогенов является избирательное связывание представителями нормальной микробиоты поверхностных рецепторов эпителиальных клеток. Нормальная микробиота кишечника способствует пищеварению: расщепляет трудноперевариваемые сложные органические вещества, оказывает влияние на морфологию слизистой и ее адсорбционную способность. С деятельностью микроорганизмов связаны обмен липидов, разложение желчных кислот, разложение белков до конечных продуктов, процессы всасывания веществ, перистальтика и многое другое. Микроорганизмы принимают участие в детоксикации попадающих из внешней среды ксенобиотиков и образующихся токсических продуктов. Масляная кислота, образующаяся при анаэробном сбраживании клетчатки кишечными микроорганизмами, способствует образованию особого фермента, инактивирующего ген, ответственный за злокачественное перерождение клетки.

Нормальная микробиота способствует усилению всасывания из кишечника ионов Fe⁺², Са⁺², витамина D, участвует в образовании витаминов К, группы В, особенно В₁, В₂, фолиевой, никотиновой, пантотеновой кислот. Высокое содержание бифидобактерий и лактобацилл препятствует развитию многих патологических процессов и даже канцерогенеза.

Нормальная микробиота способствует созреванию и поддержанию иммунной системы. У стерильных животных (гнотобионтов) масса лимфатических узлов снижена в несколько раз по сравнению с нормальными животными. Гнотобионты не могут жить в обычных условиях, где есть микробное окружение и погибают от бактерий и вирусов, к которым животные, выросшие в нормальных условиях, нечувствительны. Даже в условиях стерильного существования гнотобионты быстро погибают от дисфункции кишечника, связанной с нарушением процессов переваривания, всасывания и детоксикации веществ из-за отсутствия нормальной микробиоты.

При нормальной колонизации слизистых оболочек бактерии, являясь антигенами, индуцируют образование антител(IgA), составляют основу местного иммунитета и не позволяют возбудителям проникнуть в ткани, а также способствуют поддержанию гомеостаза самих слизистых оболочек.

Тепло, которое выделяется в процессе метаболизма микробов — обитателей кишечника, способствует поддержанию постоянной температуры тела теплокровных животных.

Продукты нормальной микробиоты постоянно попадают в кровь, оказывая влияние на метаболизм макроорганизма. Нарушение симбиоза микро- и макроорганизма приводит к тяжелым последствиям: нарушению обменных процессов, аллергическим, кожным, онкологическим заболеваниям и даже к психическим расстройствам.

Нормальная микробиота способна вызывать развитие инфекционных заболеваний, большая часть которых носит оппортунистический (сопровождающий) характер. Например, кишечные анаэробы (бактероиды) при проникновении в стенку кишечника в результате травмы вызывают формирование абсцессов, а основными возбудителями постгриппозных пневмоний считают микроорганизмы, обитающие в носоглотке любого человека. Ведущую роль в развитии подобных поражений играет не вирулентность самого возбудителя, а ослабление защитных систем макроорганизма (иммунодефицит).

21.8 Дисбактериоз (дисбиоз)

Дисбактериоз проявляется в нарушении качественного и количественного состава микробиоты и перемещении ее в другие биотопы. Развитию дисбактериозов способствует длительное применение антибиотиков и антисептиков, угнетающих развитие одних видов микробов и не влияющих на другие. Антимикробная терапия сопровождается дисбактериозом в 90% случаев. Важным фактором является снижение местного и общего иммунитета в результате гормонотерапии, применения иммунодепрессантов, лучевой терапии, инфекционных и аллергических заболеваний, воспалительных процессов. Одной из важных причин развития дисбактериоза является стресс. Группу риска составляют люди, находящиеся в состоянии постоянного напряжения: летчики, моряки, бизнесмены, спортсмены, врачи, журналисты, а также жители экологически неблагоприятных территорий и пожилые люди. Общее ухудшение экологической обстановки, низкое качество воды, неполноценное и несбалансированное питание также могут стать причиной дисбактериоза. Наиболее часто встречается дисбактериоз кишечника, который проявляется в нарушении его работы, сопровождается общим недомоганием, болями в области живота и повышенным газообразованием. Длительное нарушение соотношения микроорганизмов в кишечнике может провоцировать развитие аллергических заболеваний, таких как бронхиальная астма, хронический бронхит, ревматоидный артрит и др.

Дисбактериоз кишечника выявляют микробиологическим методом. По результатам посевов кишечной микробиоты определяют:

1) содержание общего количества кишечных палочек, типичных по ферментативной активности;

2) наличие гемолитических штаммов Е. coli;

3) наличие прочих условно-патогенных микроорганизмов;

4) наличие бактерий рода Proteus;

5) наличие грибов рода Candida;

6) количественное содержание бифидобактерий, лактобактерий, бактероидов.

В таблице 44 приведен состав нормальной микробиоты кишечника. Для коррекции дисбактериозов используют препараты эубиотиков (пробиотиков), которые содержат живые лиофильно высушенные клетки бактерий (табл. 45).

Таблица 44. Содержание различных бактерий в фекалиях здоровых взрослых лиц

Таблица 45. Эубиотики (пробиотики), применяющиеся для лечения и профилактики дисбактериозов

21.9 Микробиота окружающей среды. Санитарно-показательные микроорганизмы

В биосфере Земли повсеместно присутствуют микроорганизмы, жизнедеятельность которых вносит важнейший вклад в круговорот углерода, азота, серы, фосфора и других элементов, а также поддерживает динамическое равновесие в биосфере. Естественными средами обитания микроорганизмов являются вода, почва, организмы растений, животных и человека. Микробиоту окружающей среды, включая свободно живущие и паразитические микроорганизмы, а также влияние микробиоты на экологическую ситуацию и здоровье человека изучает санитарная микробиология. Главной задачей санитарной микробиологии является раннее обнаружение патогенной микробиоты в окружающей среде. Основными источниками распространения возбудителей инфекционных заболеваний являются человек и теплокровные животные. Наибольшее их количество поступает в окружающую среду воздушно-капельным и фекальным путями.

Непосредственное обнаружение патогенных микроорганизмов, несмотря на разработанные методы их ускоренного и прямого количественного определения, имеет ряд трудностей:

— патогенные микроорганизмы находятся в окружающей среде непостоянно, легко их можно обнаружить в период эпидемий и трудно — в межэпидемические периоды;

— количество патогенных микроорганизмов, поступающих в окружающую среду, значительно меньше, чем представителей нормальной микробиоты, распространены патогенные микробы в объектах неравномерно;

— при посеве на питательные среды патогенные микробы страдают от конкуренции с сапротрофами, являясь плохо приспособленными к жизни в окружающей среде, патогенные микроорганизмы требуют применения «богатых» и поэтому дорогостоящих питательных сред.

Отрицательный результат обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды еще не говорит с достоверностью об их отсутствии. В санитарной микробиологии оценку состояния различных объектов проводят непрямым путем, устанавливая факт их загрязнения выделениями человека и животных и чем обильнее это загрязнение, тем более вероятно попадание в объект патогенных микробов.

Состав нормальной микробиоты разных биотопов организма человека довольно постоянен и мало меняется при инфекционных заболеваниях. Для многих видов полость рта, кишечник, ВДП являются единственной средой обитания. Обнаружение таких микроорганизмов в каком-либо объекте свидетельствует о его загрязнении соответствующими выделениями. Например, обнаруживая нормальных обитателей кишечника, можно сделать заключение о наличии фекального загрязнения и возможной опасности присутствия брюшнотифозных, дизентерийных палочек, возбудителей других кишечных инфекций.

Выделяемые в таких случаях микробы служат показателями санитарного неблагополучия, потенциальной опасности исследуемых объектов и поэтому названы санитарно-показательными (СПМ). Однако не все микроорганизмы, входящие в состав нормальной микробиоты тела человека, могут быть признаны СПМ.

21.9.1 Основные требования, предъявляемые к санитарно-показательным микроорганизмам [28, 37]

1. Такие микроорганизмы должны постоянно содержаться в выделениях человека и теплокровных животных и поступать в окружающую среду в больших количествах.

2. Они не должны иметь другого природного резервуара, кроме организма человека и животных.

3. После выделения в окружающую среду они должны сохранять жизнеспособность в течение сроков, близких к срокам выживания патогенных микробов, поступающих в окружающую среду тем же путем.

4. Они не должны размножаться в окружающей среде.

5. У микробов не должно быть во внешней среде «двойников» или аналогов, с которыми их можно спутать.

6. Они не должны изменять свои биологические свойства во внешней среде.

7. Они должны быть достаточно типичными, чтобы их диагностика осуществлялась без особого труда.

8. Методы идентификации должны быть простыми, доступными и экономичными.

21.9.2 Принципы и методы проведения санитарно-микробиологических исследований

При проведении санитарно-микробиологических исследований необходимо выполнять следующие требования.

1. Правильный отбор проб.

Его проводят с соблюдением всех необходимых правил асептики; при хранении и транспортировке необходимо исключить возможность гибели и дополнительного размножения микроорганизмов. При невозможности немедленно сделать анализ- материал хранят не более 6-8 часов.

2. Серийность проводимых анализов.

Микроорганизмы в объектах окружающей среды распределены крайне неравномерно. Для получения адекватных результатов проводят отбор серии проб из разных участков объекта. При проведении анализов все образцы смешивают и отбирают среднюю пробу.

3. Повторность отбора проб.

Для получения сопоставимых результатов осуществляют повторный отбор проб в связи с тем, что в исследуемых образцах состав микробиоты меняется достаточно быстро.

4. Применение стандартных методов исследования.

Использование методик, утвержденных ГОСТ, позволяет получать в разных лабораториях сопоставимые результаты.

5. Использование комплекса тестов необходимо для получения адекватной информации при сочетании прямых и косвенных методов выявления микроорганизмов с учетом влияния факторов внешней среды и собственной микробиоты объекта.

Современная санитарная микробиология стремится использовать простые, точные и надежные методы. Они направлены на определение общей микробной загрязненности и выявления СПМ и включают:

— прямой подсчет при микроскопии микроорганизмов в объекте;

— методы выделения и идентификации микроорганизмов;

— биологические методы с использованием лабораторных животных.

Прямой подсчет применяют в экстренных случаях при необходимости

срочного ответа о количественном содержании бактерий (например, при авариях в системе водоснабжения, при оценке эффективности работы очистных сооружений и др.). Основной недостаток — невозможность получить точный ответ из-за образования бактериями агломератов или прикрепления к частицам среды. Метод не позволяет отличать живые бактерии от погибших.

Посев на питательные среды производят для количественного подсчета. На плотных питательных средах производят подсчет числа выросших колоний. При этом исходят из предположения, что каждая колония является результатом попадания на среду одной жизнеспособной клетки. Данный метод неточен, т. к. выявляет только группы микроорганизмов, растущих на определенных питательных средах при определенной температуре. Невозможно создать унифицированную, подходящую для всех микроорганизмов среду. Не все микроорганизмы, находящиеся в объекте, дают колонии на питательной среде из-за конкуренции и антагонизма.

Содержание числа живых клеток в объекте отражает показатель общего микробного числа (ОМЧ) в г (мл) анализируемого материала. Содержание СПМ выражают в титрах и индексах:

Титр СПМ — наименьший объем исследуемого материала в г (мл), в котором обнаружена одна живая клетка СПМ.

Индекс СПМ — количество клеток СПМ, обнаруженных в определенном объеме (массе): для воды в 1 л, для почвы — в 1 г.

Индекс — величина, обратная титру.

21.10 Характеристика основных групп СПМ

СПМ условно разделяют на 3 группы.

Первая группа включает обитателей кишечника человека, их расценивают как индикаторы фекального загрязнения. В нее входят колиформные бактерии, энтерококки, сульфитвосстанавливающие клостридии (включая Clostridium perfringens), коли-фаги.

Вторая группа включает обитателей верхних дыхательных путей и носоглотки. Они являются индикаторами воздушно-капельного загрязнения среды. В нее входят α- и β-стрептококки и стафилококки.

Третья группа включает сапротрофные микроорганизмы, обитающие во внешней среде. Это индикаторы процессов самоочищения. В нее входят бактерии-аммонификаторы и нитрификаторы, некоторые спорообразующие бактерии, актиномицеты, цианобактерии и грибы.

21.10.1 Колиформные бактерии

Преимущество этих бактерий как СПМ связано с тем, что они являются постоянными обитателями кишечника и постоянно выделяются с фекалиями в окружающую среду в больших количествах, их число намного выше, чем других представителей кишечных микроорганизмов.

В настоящее время в соответствии с нормативнотехнической документацией СПМ являются:

а) колиформные бактерии (общие), расщепляющие только лактозу до кислоты и газа при 37°C в течение 24 часов;

б)фекальные колиформные палочки (ФКП) (термотолерантные), расщепляющие только лактозу до кислоты и газа при температуре +43- +44,5°C.

Сама кишечная палочка как санитарно-показательный микроорганизм имеет ряд недостатков.

1. В окружающей среде можно обнаружить ее аналоги и в связи с этим появляется необходимость использовать дополнительные биохимические тесты для идентификации.

2. Она менее устойчива к неблагоприятным воздействиям внешней среды (изменениям pH, повышенным концентрациям химических веществ), чем некоторые патогены.

3. Кишечная палочка может размножаться в воде при содержании органических веществ не менее 0,28 мкг/мл.

4. Не всегда удается четко оценить эпидемическую опасность, исходя только из числа клеток Е. coli, например, известны вспышки сальмонеллеза водного происхождения при содержании бактерий 17 кл/л, в то время как содержание Е. coli не превышало 4 кл/л.

21.10.2 Энтерококки

Все виды и варианты энтерококков имеют санитарно-показательное значение и отвечают ряду требований, предъявляемых к СПМ.

1. Это постоянные обитатели кишечника, несмотря на то, что их количество меньше, чем Е. coli.

2. Они не способны размножаться во внешней среде (точнее, могут размножаться при содержании органических веществ 375 мкг/л и температуре, равной 20°C и выше).

3. Не предъявляют выраженной изменчивости во внешней среде, что облегчает их распознавание.

4. Не имеют аналогов во внешней среде.

5. Отмирают во внешней среде значительно раньше, чем Е. coli, поэтому всегда свидетельствуют о свежем фекальном загрязнении.

Самым главным достоинством является их устойчивость к неблагоприятным внешним воздействиям. Они устойчивы к нагреванию до 65°C в течение 30 мин, что делает их показателем качества режима пастеризации. Энтерококки устойчивы к высоким концентрациям NaCl (6,5-17%), что позволяет использовать их при анализе морской воды. Энтерококки устойчивы в диапазоне pH 3-12, что можно использовать при анализе стоков кислого и щелочного характера.

В настоящее время количественная энтерококкометрия принята международным стандартом по воде как дополнительный показатель фекального загрязнения, а при выявлении атипичных Е. coli — главным методом выявления фекального загрязнения.

Трудности в индикации энтерококков состоят в необходимости использовать среды сложного состава и в том, что для их выявления требуется больше времени, чем для БГКП.

21.10.3 Клостридии

Клостридии выделяются в окружающую среду с фекалиями, но их количество меньше, чем БГКП и энтерококков, и составляет 10⁵-10 ⁶ кл/г. К СПМ относят Clostridium perfringens и Cl. sporogenes. Основным биохимическим признаком для идентификации клостридий является способность образовывать черные колонии на железосульфитной среде за счет образования FeS. Эта среда позволяет дифференцировать клостридии фекального загрязнения от клостридий, обитающих во внешней среде. Кишечные клостридии восстанавливают сульфиты и вызывают почернение среды, а свободно живущие не имеют сульфитредуктазы и не изменяют цвет среды. Следует отметить, что почернение среды могут вызывать другие бактерии, например, Е. coli. Для подавления роста сопутствующей микробиоты посевы выращивают при 43-44,5°C или прогревают при 80°C 15-20 мин. Простота обнаружения на среде Вильсон-Блера и некоторых других средах является существенным преимуществом кишечных клостридий как СПМ. Однако у них имеются и некоторые недостатки.

1. Cl. perfringens может длительно сохраняться во внешней среде за счет спорообразования. Обнаружение этого микроба свидетельствует об имевшем место фекальном загрязнении. В связи с тем, что для спор Сl. perfringens губительным является содержание остаточного хлора 1,2-1,7 мг/л, как и для энтеровирусов, обнаружение микроба свидетельствует о возможном присутствии энтеровирусов в воде.

2. Сl. perfringens может размножаться во внешней среде при температуре не менее 18-20°С и достаточном количестве питательных веществ, например, в гумусных почвах южных широт. Для прорастания спор необходим температурный шок, т. е. прогревание при 70° в течение 15-30 мин. Без прогрева прорастает лишь 0,1-3% спор.

О давности фекального загрязнения предложено судить, сопоставляя содержание споровых и вегетативных форм. С этой целью определяют количество клостридий в непрогретых и прогретых пробах. В прогретых пробах присутствуют только споровые формы, что свидетельствует о давнем фекальном загрязнении. В непрогретых пробах выявляют вегетативные и споровые формы. Большое число вегетативных форм свидетельствует о свежем фекальном загрязнении. Однако на практике количество Сl. perfringens в непрогретых пробах бывает ниже, чем в прогретых. Это обусловлено антагонистическим влиянием сопутствующей микробиоты или отсутствием температурного шока в непрогретых пробах.

В отечественной практике о давности фекального загрязнения судят, сопоставляя индексы БГКП и Сl. peгfгingens. Если оба показателя имеют высокое значение, то делают заключение о наличии свежего фекального загрязнения. Высокое значение индекса БГКП и низкое значение индекса клостридий указывает на давнее загрязнение.

21.10.4 Стрептококки и стафилококки

Гемолитические и зеленящие стрептококки являются обитателями верхних дыхательных путей и попадают в воздух со слюной и мокротой.

Основная трудность в использовании этих микроорганизмов как СПМ состоит в том, что стрептококки представляют большую группу микроорганизмов, вызывающих заболевания (скарлатину, ангину, рожистое воспаление и др.).

Для культивирования используют кровяной агар; α-гемолитические стрептококки встречаются у 100% населения, β-стрептококки у 25-76%, поэтому СПМ считают α и β-стрептококки. По срокам жизни стрептококки совпадают с возбудителем дифтерии и другими патогенными микробами, попадающими в организм человека аэрогенным путем.

Обнаружение α-стрептококков (наименее устойчивых) свидетельствует о свежем воздушно-капельном загрязнении. В воздухе помещений, где люди отсутствуют, стрептококки не обнаруживаются.

Стафилококк попадает в воздух с поверхности кожи, а также при разговоре и кашле с выделениями слизистых оболочек ВДП. Для мест сброса воды бассейнов количество стафилококков является важным показателем санитарного состояния воды. Стафилококки в воде выживают дольше, чем БГКП и энтерококки. Однако используют стафилококки в основном, как СПМ воздуха закрытых помещений.

Превосходство этих бактерий как СПМ над стрептококками заключается в более простой и быстрой индикации, неприхотливости к питательным средам. Стафилококки обладают устойчивостью к различным физическим и химическим факторам, поэтому их можно использовать как СПМ воды в зонах рекреации и бассейнов.

21.10.5 Бактериофаги

В качестве СПМ предложено использовать бактериофаги кишечных бактерий (эшерихий, сальмонелл и шигелл). Кишечные фаги постоянно обнаруживают там, где есть бактерии, к которым они адаптированы. Однако, как показатели возможного присутствия патогенных бактерий они имеют определенные недостатки: 1) бактериофаги выживают в окружающей среде дольше (8-9 мес.), чем соответствующие бактерии (4-5 мес.); 2) они способны адаптироваться к другим видам бактерий.

Однако, как показатели фекального загрязнения они имеют важное значение, поскольку выделяются из сточных вод с той же частотой, что и многие вирусы (коксаки, гепатита А, полиомиелита). Их устойчивость к дезинфектантам сопоставима с устойчивостью энтеропатогенных вирусов. Обнаружить фаги можно, используя простые методы.

21.11 Санитарная микробиология воды

Вода является естественной средой обитания разнообразных микроорганизмов. В пресной и соленой воде выявляют представителей всех таксономических групп бактерий, многих простейших и грибов. На качественный состав микробиоты существенное влияние имеет происхождение воды как среды обитания. Различают поверхностные (реки, озера, водохранилища, пруды и т. д.), подземные (почвенные, грунтовые, артезианские) и соленые (моря, озера) водоемы.

Микробиоту водоемов определяют аутохтонные (водные) и аллохтонные (попадающие при загрязнении) микроорганизмы. Загрязнение водоемов может происходить при попадании сточных вод: промышленных (особенно с предприятий пищевой промышленности), хозяйственно-фекальных, талых, ливневых.

Аутохтонной микробиотой называют совокупность микроорганизмов, постоянно живущих и размножающихся в воде. Как правило, микробный состав воды напоминает микробиоту почвы, с которой она соприкасается. В состав водной микробиоты входят Micrococcus candicans, M. roseus, Sarcina lutea, Pseudomonas fluorescens, различные виды Proteus и Leptospira.

В незагрязненных водоемах выявляют Bacillus cereus, Bac. mycoides, Chromobacterium, Clostridium. В воде часто обнаруживают цианобактерии, водные грибы, простейшие. Микроорганизмы воды принимают участие в круговороте веществ, расщепляя органические соединения, обеспечивают питанием других обитателей водоемов.

В результате микробного загрязнения при попадании неочищенных городских отходов и стоков в воду могут проникать возбудители инфекционных заболеваний: холеры, брюшного тифа и паратифа А, В; лептоспирозов, йерсиниозов, кампилобактериозов, туляремии, полиомиелита, гепатита и др.

Вода не является благоприятной средой обитания патогенных микроорганизмов, приспособленных к организму человека и животных. Поэтому происходит их постепенное отмирание и освобождение воды от контаминирующих микроорганизмов. Основным фактором очистки является конкурентная деятельность сапротрофной микробиоты. В результате быстрого разложения органических веществ сапротрофами резко снижается численность микроорганизмов, особенно фекального происхождения. Способность к самоочищению обусловлена присутствием в воде постоянных видов, входящих в конкретный биоценоз.

По количеству микроорганизмов различают полисапробные (sapros — гниение), мезосапробные и олигосапробные зоны.

Полисапробные зоны (зоны сильного загрязнения) содержат большое количество разлагающихся органических веществ и почти полностью лишены кислорода. Количество бактерий до 10⁶/мл. Видовой состав ограничен анаэробными бактериями, грибами, актиномицетами.

Мезосапробные зоны (умеренного загрязнения) характеризуются разнообразным качественным составом микроорганизмов; в основном это нитрифицирующие, облигатно анаэробные бактерии, а также представители Clostridium, Pseudomonas, Mycobacterium, Flavobacterium, Streptomyces и др. Общее количество — 10 ⁵ кл/мл.

Олигосапробные зоны (зоны чистой воды) характеризуются небольшим содержанием органических соединений и окончанием минерализации. Количество бактерий 10-10³ кл/мл.

При санитарно-микробиологическом анализе воды определяют общее микробное число (ОМЧ) — количество жизнеспособных микроорганизмов в 1 л воды и количество санитарно-показательных микроорганизмов.

СПМ для воды являются общие колиформные и термотолерантные кишечные палочки, Clostridium perfringens, Cl. sporogenes и бактериофаги. При необходимости определяют фекальные энтерококки (Enterococcus faecalis).

В соответствии с Санитарными правилами и нормами 2.1.4.1074-01 к воде центрального водоснабжения предъявляются следующие требования; ОМЧ не более 50 кл/мл; не допускается в 100 мл присутствия общих колиформных и термотолерантных бактерий, а также колифагов; не допускается присутствия сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл и цист лямблий в 50 мл.

21.12 Санитарная микробиология почвы

Почва является главным резервуаром и естественной средой обитания микроорганизмов, принимающих участие в процессах формирования и самоочищения почвы и в круговороте веществ в природе [41]. Качественный состав микробиоты почвы очень разнообразен и включает преимущественно спорообразующие бактерии, актиномицеты, спирохеты, архебактерии, простейшие, цианобактерии, грибы, вирусы, микоплазмы. Состав микробиоты сильно зависит от вида почвы, способов ее обработки, содержания органических веществ, влажности, климатических условий и других причин.

В песчаных почвах преобладают аэробные микроорганизмы, в глинистых — анаэробные. Наибольшее их число находится в прикорневой зоне растений, где компоненты микробного пейзажа, специфичные для каждого вида растений, образуют зону интенсивного размножения и повышенной активности (ризосферная зона).

Количество микроорганизмов в почве достигает нескольких миллиардов в 1 г, больше всего в унавоженной почве (до 4,8-5,2 млрд. кл/г), меньше в лесной почве, в песках (1,2-0,9 млрд. кл/г).

На 1 гектаре почвы живая масса составляет 1000 кг. Распределение микроорганизмов неравномерно. Наиболее многообразна и многочисленна микробиота на глубине 10-20 см, где протекают биохимические процессы превращения органических веществ с участием микроорганизмов. В более глубоких слоях число микроорганизмов снижается.

В почву, как и в воду, вместе со сточными водами могут попадать представители нормальной микробиоты человека и животных, а также патогенные микроорганизмы. Как правило, они длительно не выживают в условиях окружающей среды. Однако многие бактерии, входящие в состав нормальной микробиоты человека, могут включаться в биоценоз почвы, а отдельные виды остаются ее постоянными обитателями. В связи с этим бывает трудно разделить микробиоту почв на резидентную и временно существующую. Для оценки роли почвы в возникновении инфекционных болезней необходимо знать возможную продолжительность сохранения и размножения патогенных микробов в почве.

В зависимости от срока жизни микроорганизмы, попадающие от человека, можно разделить на 3 группы.

1. Патогенные микроорганизмы, постоянно обитающие в почве, например, Clostridium botulinum. Попадая с фекалиями, могут неопределенно долго сохраняться в почве.

2. Спорообразующие патогенные микроорганизмы, для которых почва является вторичным резервуаром. Попадают с фекалиями человека и животных, а также с трупами животных. При благоприятных условиях могут размножаться и сохраняться в виде спор длительное время.

3. Патогенные микроорганизмы, попадающие с выделениями человека и животных и сохраняющиеся несколько недель или месяцев. В эту группу входят неспорообразующие бактерии, на сроки их сохранения влияет антагонистическая активность микробиоты почвы.

Санитарно-микробиологический контроль проводят по двум показателям: 1) общему микробному числу, показывающему число живых клеток в 1 г почвы; 2) наличию СПМ (БГКП, Clostridium perfringens, Cl. sporogenes, Enterococcus faecalis). Высокая численность сапротрофной микробиоты свидетельствует об органическом загрязнении, а при микробной контаминации выделениями человека и животных преобладают СПМ.

21.13 Санитарная микробиология воздуха

Воздух не является естественной средой обитания микроорганизмов, в воздухе микробы не питаются и не способны размножаться. Жизнеспособность микроорганизмов в воздухе обеспечивают взвешенные частицы воды, слизи, пыли, частицы почвы.

Атмосферный воздух и воздух закрытых помещений существенно различаются по качественному и количественному составу микробиоты. Бактериальная обсемененность жилых и некоторых типов производственных помещений всегда превышает обсемененность атмосферного воздуха. Условно микробиоту наружного воздуха разделяют на резидентную (наиболее часто обнаруживаемую) и временную, менее стойкую к воздействию губительных факторов и обнаруживаемую спорадически.

Постоянная микробиота атмосферного воздуха формируется за счет почвенных организмов, в ее состав входят Micrococcus roseus, M. flavus, M. candicans, Sarcina flava, S. rosea, Bacillus subtilis, B. mycoides, B. mesentericus, виды Streptomyces, Penicillium, Aspergillus, Mucor и др.

Временная микробиота формируется за счет микроорганизмов, поступающих из почвы и с поверхности водоемов.

Контаминация воздуха закрытых помещений происходит капельным путем в составе аэрозоля при разговоре, кашле, чихании. Кроме того, микробы попадают со слущивающимся эпителием кожных покровов, с пылинками одежды и частичками почвы.

Аэрозоль представляет собой коллоидную систему из капелек влаги и твердых частиц, на которых адсорбированы микроорганизмы. Размеры частиц аэрозоля — от 10-100 до 2000 нм. В зависимости от размера капель, их электрического заряда и скорости движения в воздухе различают следующие фазы:

Капельная фаза, которая представлена мелкими каплями, длительно сохраняющимися в воздухе и испаряющимися до оседания.

Пылевая фаза представлена крупными, быстро оседающими и испарящимися каплями. В результате образуется пыль, способная подниматься в воздушную среду.

Капельные ядрышки. Мелкие капельки аэрозоля (до 100 нм), высыхая, остаются в воздухе во взвешенном состоянии и образуют устойчивую аэродисперсную систему. В них частично сохраняется влага, поддерживающая жизнеспособность микроорганизмов.

Санитарно-микробиологическому контролю подлежит воздух закрытых помещений. В нем определяют ОМЧ (число жизнеспособных микроорганизмов в 1 м³ воздуха). В лечебных учреждениях дополнительно оценивают СПМ (стафилококки, α и β-гемолитические стрептококки).

В производственных помещениях определяют ОМЧ, анализ на СПМ не проводят. Допустимый уровень содержания микроорганизмов в воздухе определяется классами чистоты помещений, необходимыми для выполнения конкретных технологических операций.