Молекулярная биология: Структура и функции белков - Степанов В.М. 2005

Первичная структура белка
Доказательство индивидуальности белка. Микрогетерогенность белков

Определению первичной структуры белка предшествуют его очистка (см. гл. 3) и установление химической индивидуальности, или, как принято говорить, гомогенности. Универсальных критериев гомогенности белка нет, наиболее строгим доказательством его индивидуальности является однозначное установление первичной структуры, требующее большого труда и времени и не всегда доступное. Практически полезными, хотя и неполными критериями индивидуальности белка служат:

✵ обнаружение при диск-электрофорезе или изоэлектрофокусировании единственной белковой полосы, проявляющей характерную для данного белка активность; весьма доказательны данные иммуно-электрофореза и иммуноблоттинга;

✵ обнаружение при электрофорезе в поли акрилам идиом геле в присутствии анионного детергента (додецилсульфата натрия) единственной полосы, отвечающей денатурированному белку, в особенности если иммуноблоттинг подтверждает, что она несет антигенные детерминанты данного белка. В случае олигомерных белков, построенных из разных субъединиц, таких полос может быть несколько, однако анализу первичной структуры должно предшествовать разделение субъединиц;

✵ обнаружение единственного белкового пика, достаточно симметричного и совпадающего с пиком активности при различных методах жидкостной хроматографии (аффинной, ионообменной, гидрофобной, гель-хроматографии). Существенно, чтобы соотношение активности и содержания белка (удельная активность) оставалось постоянным по всему пику;

✵ выявление единственной аминоконцевой последовательности. К идентификации аминоконцевого остатка для этой цели прибегают редко, так как расход белка для получения столь ограниченной информации оказывается неоправданно большим.

Эти приемы не единственны и не обязательны, доказательство индивидуальности строится по-новому для каждого белка. Нередко при этом обнаруживается так называемая микрогетерогенность белка, вызываемая, как правило, неоднозначностью посттрансляционных. модификаций или случайными повреждениями белковых молекул in vivo или в процессе выделения. Возможна, впрочем, и гетерогенность, обусловленная функционированием аллельных генов, или альтернативным сплайсингом.

Среди наиболее частых причин микрогетерогенности укажем внутренние разрывы полипептидной цепи за счет случайного действия протеиназ, так называемые растрепанные концы (результат неоднозначного процессинга аминоконцевого участка белка), а также дезамидирование отдельных остатков аспарагина, реже глутамина. Последнее может происходить спонтанно, в особенности легко — в последовательности Asn—Gly и приводит к так называемой микрогетерогенности по заряду. Известна микрогетерогенность за счет неполноты фосфорилирования белка протеинкиназами или различий в структуре углеводных цепей гликопротеинов.

Высказываемые иногда предположения о микрогетерогенности, обусловленной существованием стабильных конформеров белка с одинаковой первичной структурой, экспериментального подтверждения не получили и труднообъяснимы теоретически. Многие виды микрогетерогенности не препятствуют определению аминокислотной последовательности, однако осложняют анализ и должны упитываться при его проведении.