Молекулярная биология: Структура и функции белков - Степанов В.М. 2005

Посттрансляционная модификация белка
Ограниченный протеолиз

Ограниченный протеолиз — важнейшая реакция посттрансляционной модификации белка. Обычный «неограниченный», глубокий протеолиз — расщепление белка протеиназами — протекает по принципу «все или ничего». Компактный белок, как правило, относительно устойчив к действию протеиназ, поскольку в нем практически нет необходимых для связывания протеолитических ферментов протяженных «открытых» участков полипептидной цепи. Поэтому атака на первых порах ограничивается расщеплением отдельных петель, концевых участков белка. Если же протеолизу подвергается «внутренний» участок полипептидной цепи, ставший доступным, например, за счет частичной (и обратимой) денатурации белковой глобулы, то пространственная структура дестабилизируется, белок-субстрат необратимо денатурирует и вся полипептидная цепь оказывается доступной протеолитической атаке. Результатом является глубокий гидролиз с образованием коротких фрагментов. При таком ходе протеолиза в гидролизате присутствуют исходный белок, количество которого постоянно уменьшается, и низкомолекулярные пептидные продукты гидролиза, содержание которых постоянно нарастает, промежуточные же продукты наблюдать не удается.

Ограниченный протеолиз, при котором процесс задерживается или полностью останавливается на промежуточных продуктах, возможен лишь тогда, когда продукты протеолиза сохраняют компактность, например при отщеплении фрагмента какого-либо из концов пептидной цепи, разрыве петли на поверхности глобулы или при расщеплении пептидной цепи между достаточно стабильными доменами белка.

Ход ограниченного протеолиза, его результат решающим образом зависят от особенностей структуры белка-субстрата. Ввиду этого нередко одинаковые или очень близкие результаты дает применение различных протеиназ, место действия которых определяется особенностями пространственного строения субстрата. Если в разрешенном для атаки участке (шарнирный участок) последовательность аминокислотных остатков согласуется со специфичностью атакующей протеиназы, то эффективность процесса возрастает. Именно так обстоит дело при посттрансляционной модификации белков протеиназами.

Рассмотрим несколько типичных процессов ограниченного протеолиза.

11.8.1. Формирование белка неканонической структуры. Биосинтез инсулина

Инсулин, построенный из двух полипептидных цепей А и В, содержащих соответственно 21 и 30 аминокислотных остатков и соединенных между собой дисульфидными связями, слишком мал, чтобы сформировать стабильную глобулярную структуру с достаточной эффективностью. Действительно, удается получить инсулин рекомбинацией раздельно синтезированных А- и В-цепей, причем остатки цистеина, окисляясь, образуют свойственную нативному белку систему дисульфидных связей. Однако такой процесс происходит медленно и дает, как правило, невысокий выход инсулина.

Гораздо легче образует третичную структуру предшественник инсулина — проинсулин, в полипептидной цепи которого «будущие» А- и В-цепи инсулина соединены пептидом С в последовательности В—С—А. Такой белок, содержащий в одной полипептидной цепи около 90 аминокислотных остатков, сворачивается в компактную структуру, далее следует замыкание дисульфидных мостиков, стабилизирующее молекулу в целом, после чего специальная протеиназа «вырезает» пептид С. Точки воздействия этой протеиназы предопределены двумя факторами — пространственной структурой проинсулина и присутствием в его полипептидной цепи двух сигналов — двух пар катионных аминокислот, расположенных в последовательности таким образом:

Процессирующая такой предшественник протеиназа узнает пары аминокислот с катионными боковыми группами типа Arg—Arg, Lys—Arg и т.п. и расщепляет пептидную связь на С-конце таких пар. В результате будет вырезан пептид С вместе с последовательностью Lys—Arg на С-конце и освободятся цепи А и В, причем на С-конце цепи В окажутся два остатка аргинина, которые необходимо отщепить. Это выполняет специализированная металлокарбоксипептидаза с оптимумом действия в слабокислой среде.

Заметим, что сочетание действия протеиназы, гидролизующей пептидные связи после пары катионных аминокислот (такие ферменты обнаружены у животных и дрожжей), и карбоксипептидазы, отщепляющей затем эти аминокислоты (по специфичности фермент близок карбоксипептидазе В), используется в биосинтезе коротких пептидов, например энкефалина. Специфичность действия такой системы достаточно высока, и процессинг длинных предшественников происходит, видимо, еще до образования стабильной пространственной структуры. Так, пептидная цепь проопиомеланокортина, содержащая 235 аминокислотных остатков, расщепляется по такому способу в семи местах, образуя эндорфин, адренокортикотропный гормон, а- и у-меланоцитостимулирующие гормоны и другие физиологически активные пептиды.

11.8.2. Разъединение белковых глобул в полибелках

В ряде случаев несколько структурно и функционально различных белков синтезируется первоначально как одна полипептидная цепь очень большой длины, отдельные участки которой независимо друг от друга свертываются в белковые глобулы, образуя так называемый полибелок. Так, например, синтезируются ферменты биосинтеза жирных кислот. Особенно характерен синтез полибелков для ретровирусов. В дальнейшем происходит разрезание специфическими протеииазами пептидных перетяжек между отдельными глобулами, после чего последние функционируют независимо. Так, в частности, разделяются компоненты полибелка вируса иммунодефицита человека. Видимо, точность расщепления полипептидных перетяжек в полибелке в этом случае столь существенна, что этот процесс не всегда может быть доверен протеиназам клетки-хозяина. Полибелок содержит весьма специфичную протеиназу вируса иммунодефицита человека, отдаленно родственную пепсину, которая узнает характерные последовательности аминокислот в перетяжках и точно разрезает их. Предполагают, что избирательное ингибирование таких протеиназ может быть использовано как один из способов борьбы с вирусной инфекцией.

11.8.3. Разделение доменов

Эта реакция используется, в частности, как необходимый этап в механизме действия ряда белковых токсинов, вырабатываемых микроорганизмами. Так, дифтерийный токсин синтезируется как протоксин, построенный из одной полипептидной цепи, которая образует по крайней мере два структурно и функционально автономных домена. Один из них ответствен за связывание токсина с рецептором мембраны атакуемой клетки, второй представляет собой фермент, катализирующий перенос аденозиндифосфатрибозного фрагмента НАД на фактор элонгации EF, который при этом инактивируется. Комплекс токсин — рецептор, обязанный своим образованием связыванию первого домена с рецептором, после интернализации (втягивания внутрь клетки) оказывается в окруженном мембраной пузырьке — везикуле.

Для того чтобы получить возможность действия на фактор элонгации EF, каталитический домен должен покинуть везикулу и оказаться в цитоплазме. Токсин содержит структуру, позволяющую каталитическому домену проникнуть через мембрану, однако и после этого он еще сохраняет связь с «узнающим» доменом. Следовательно, он не сможет покинуть везикулу, пока протеиназа подходящей специфичности не расщепит междоменный участок пептидной цепи. Это высвобождает каталитический домен и позволяет ему сблизиться с фактором EF.

Расщепление пептидной связи между а- и β-субъединицами рецептора инсулина необходимо для активации этого белка. Соеди няющий (шарнирный) участок пептидной цепи содержит очень характерную сигнальную последовательность Arg—Lys—Arg- Arg— Хаа, в которой связь Arg—Хаа расщепляется специфическим протеолитическим ферментом. Найдены носители аномального гена рецептора инсулина, в котором отмеченная последовательность заменена на Arg—Lys—Arg—Ser—Хаа. Замена Arg на Ser делает белок устойчивым к процессирующей протеиназе, домены не разделяются, что приводит к образованию неактивного рецептора. Гомозиготные носители такого мутантного гена страдают диабетом, который не компенсируется инсулином.

Интересно, что аналогично построенная сигнальная последовательность четырех катионных аминокислот определяет протеолитическую активацию гемагглютинина вируса гриппа, а также созревание гликопротеина поверхности вируса иммунодефицита человека.

11.8.4. Активация предшественников ферментов

Многие ферменты, в особенности гидролазы, синтезируются в виде неактивных предшественников — проферментов, или зимогенов. Наиболее изучена активация предшественников панкреатических сериновых протеиназ — трипсиногена и химотрипсиногена. В обоих случаях пептидная цепь фермента удлинена с аминного конца на несколько аминокислотных остатков — активационный пептид, протеолитическое отщепление которого превращает практически неактивный зимоген в активную протеиназу. Так, в трипсиногене быка аминоконцевая последовательность имеет такую структуру:

Гидролиз трипсином именно пептидной связи Lys—Ile определяется прежде всего ее доступностью: в молекуле трипсиногена содержится целый ряд пептидных связей, образованных остатками аргинина или лизина и атакуемых трипсином в денатурированном зимогене, однако в нативном белке расщепляется первой именно эта связь. При активации трипсиногена образуется трипсин, способный активировать другие молекулы профермента, так что реакция в целом оказывается аутокаталитической и протекает с резким ускорением.

Характерно, что скорость активации, обеспечиваемая трипсином, in vivo все же оказывается недостаточной, и активация инициируется специальным протеолитическим ферментом энтеропептидазой (энтерокиназой), который содержится в секрете двенадцатиперстной кишки и активирует трипсиноген примерно в 1000 раз быстрее трипсина. Столь высокая специфичность энтеропептидазы обусловлена тем, что фермент узнает в трипсиногене предшествующую остатку лизина гроздь из четырех остатков аспарагиновой кислоты.

Отщепление активационного пептида от молекулы трипсиногена влечет за собой цепь изменений в пространственной структуре продукта активации. Аналогичные изменения претерпевает и продукт активации химотрипсиногена, хотя активационный пептид в этом случае выглядит совершенно иначе и сохраняет ковалентную связь с ферментом за счет дисульфидной связи. Освободившаяся при активации аминогруппа остатка изолейцина (аминоконцевого в трипсине) протонируется. Катионная аммонийная группа втягивается в глубь глобулы фермента вследствие стремления гидрофобных боковых групп остатков изолейцина и валина уменьшить поверхность контакта с водой.

Этому способствует образование ионной пары между а-аммонийной группой изолейцина и отрицательно заряженным карбоксилат-ионом боковой группы остатка Asp-194, причем разрывается существовавшая в зимогене ионная пара Asp-194—His-40. Смещение карбоксильной группы остатка Asp-194 приводит к локальным структурным перестройкам вблизи зоны связывания субстрата, в частности, завершается формирование гидрофобного кармана за счет движения боковой цепи остатка Met-192. Видимо, немалую роль могут играть и некоторые уточнения в размещении функциональных групп каталитического центра. Заметим, что этот центр, по крайней мере в грубом приближении, предсуществует еще в проферменте, который обнаруживает (по небольшим субстратам) около 0,01% активности, присущей активному трипсину.

Активация трипсиногена сопровождается как бы фиксацией, более точной организацией около 15% пространственной структуры: соответствующие атомы испытывают значительные колебания в молекуле профермента, но закрепляются в трипсине. Таким образом, расщепление пептидной связи Lys—Не запускает весьма сложный механизм локальных перестроек, активирующий молекулу. Вслед за описанной начальной реакцией, определяющей образование активного фермента, наблюдается гидролиз других пептидных связей. Он приводит к образованию новых молекулярных форм трипсина, иногда несколько отличающихся от первичного продукта активации функциональными свойствами, например деталями специфичности. Сходно протекает активация химотрипсиногена, инициируемая также трипсином. Последующее расщепление некоторых связей в активном химотрипсине другими его молекулами дает целый набор молекулярных форм фермента.

Такой же механизм положен в основу активации протеиназ системы свертывания крови, в которых при протеолизе единой полипептидной цепи обнажается а-аминогруппа N-концевого остатка в каталитическом домене активного фермента, что запускает, по-видимому, такую же цепь изменений структуры, активирующую фермент.

Разница состоит в том, что аминоконцевой район профермента, подчас очень крупная структура, сохраняет связь с собственно каталитическим ядром за счет дисульфидных и, вероятно, нековалентных взаимодействий. Это позволяет сообщить протеиназе новые функциональные особенности, например способность к связыванию с липидами мембран через ионы кальция за счет остатков у-карбоксиглутаминовой кислоты (см. разд. 11.3).

В предшественниках других, протеиназ — пепсиногене и прокарбоксипептидазе — отщепляемый при активации (соответственно пепсином или трипсином) пептид содержит около 40 аминокислотных остатков и, видимо, играет роль своеобразного экрана, прикрывающего активный центр фермента. Отщепление этого экрана, которое не требует строго однозначного протеолиза, как в случае рассмотренных выше сериновых протеиназ, и может быть результатом разрыва любой пептидной связи в последовательности, соединяющей активационный пептид с будущим ферментом. Отсюда неоднозначность активации, которая может приводить к смеси активных ферментов, различающихся длиной и аминоконцевыми остатками (так называемые растрепанные концы).

Биологический смысл активации проферментов очевиден: она позволяет накопить значительные количества предшественника, чрезвычайно быстро превращаемого в активный фермент в результате всего лишь одной реакции — расщепления единственной пептидной связи. Синтез значительных количеств фермента de novo потребовал бы гораздо большего времени, что невыгодно, особенно в процессах пищеварения. В то же время накопление активных протеиназ внутри клетки может оказаться для нее далеко не безобидным. Биосинтез профермента позволяет снять и эту проблему.

Не следует думать, что активация зимогенов характерна лишь для ферментов животных. Обнаружено, что в виде предшественников синтезируются практически все протеиназы бактерий.