ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 1. ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ - 2011

ЧАСТЬ I. СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ

6. ФЕРМЕНТЫ

Вопросы и задачи

1. Сохранение сладкого вкуса кукурузы.

Сладкий вкус зерен в свежесобранных початках кукурузы обусловлен высоким содержанием в них сахара. Через несколько дней после сбора кукуруза уже не такая сладкая, поскольку за один день хранения около 50% свободного сахара в зернах превращается в крахмал. Чтобы лучше сохранить сладкий вкус свежесобранной кукурузы, очищенные початки на несколько минут помещают в кипящую воду («бланшируют»), а затем охлаждают в холодной воде. Кукуруза, обработанная таким образом и хранящаяся в замороженном виде, сохраняет свой сладкий вкус. В чем биологический смысл подобной процедуры?

2. Внутриклеточная концентрация ферментов.

Чтобы оценить концентрацию ферментов в бактериальной клетке, предположим, что в цитозоле содержатся равные концентрации 1000 разных ферментов и что молекулярная масса каждого белка составляет 100 000. Кроме того, предположим, что бактериальная клетка представляет по форме цилиндр диаметром 1 мкм и высотой 2 мкм, что цитозоль (плотность 1,20) содержит 20% по массе растворимого белка, и что весь этот белок полностью состоит из ферментов. Рассчитайте среднюю молярную концентрацию каждого фермента в данной гипотетической клетке.

3. Ускорение реакции под действием уреазы.

Фермент уреаза при pH 8,0 и 20 °С ускоряет гидролиз мочевины в 1014 раз. Если заданное количество мочевины может полностью прогидролизовать заданное количество уреазы при pH 8,0 и 20 °С за 5 мин, сколько времени потребовалось бы для гидролиза того же количества мочевины в тех же условиях, но без фермента? Предполагается, что обе реакции происходят в стерильных условиях без доступа бактерий.

4. Защита фермента от тепловой денатурации.

При нагревании раствора фермента происходит постепенная потеря его каталитической активности, что связано с денатурацией фермента. При инкубации раствора гексокиназы в течение 12 мин при 45 °С фермент теряет 50% активности, но если инкубацию проводить в присутствии очень высокой концентрации одного из субстратов, то потеря активности за 12 мин составляет лишь 3%. Объясните, почему тепловая денатурация гексокиназы замедляется в присутствии субстрата.

5. Требования к активным центрам ферментов.

Карбоксипептидаза, последовательно отщепляющая С-концевые аминокислотные остатки своих пептидных субстратов, представляет собой полипептид, состоящий из 307 остатков. Две основные каталитические группы в активном центре фермента — это Arg¹⁴⁵и Glu²⁷⁰.

а) Если бы цепь карбоксипептидазы была свернута в идеальную α-спираль, то на каком расстоянии друг от друга (в Â) находились бы остатки Arg¹⁴⁵и Glu²⁷⁰. Подсказка: см. рис. 4-4, а.

б) Объясните, каким образом эти две аминокислоты могут катализировать реакцию, происходящую на расстоянии в несколько ангстрем.

6. Количественное определение лактатдегидрогеназы.

Фермент мышц лактатдегидрогеназа катализирует реакцию

NADH и NAD+ — это соответственно восстановленная и окисленная формы кофермента NAD. Раствор NADH, но не NAD⁺, поглощает свет с длиной волны 340 нм. Это свойство используется для определения концентрации NADH в растворе с помощью спектрофотометрического измерения поглощения света при 340 нм. Объясните, как данное свойство NADH может быть использовано для количественного определения лактат- дегидрогеназы.

7. Роль фермента в химической реакции.

Какие из перечисленных ниже изменений в ходе простой химической реакции могут быть вызваны присутствием катализатора?

а) Снижение К'_eq', б) повышение r₁; в) повышение K'_eq; г) повышение ∆G*; д) понижение ∆G"; е) более отрицательное значение ∆G'°; ж) повышение r_2.

8. Связь между скоростью реакции и концентрацией субстрата: уравнение Михаэлиса- Ментен.

а) При какой концентрации субстрата фермент с r_cat = 30 с^-1 и К_м = 0,005 М будет катали

зировать реакцию со скоростью, равной 1/₄ его максимальной скорости?

б) Определите, какая доля Vm_ах будет достигнута при концентрациях субстрата [S] = 1/2 К_м, 2К_м и 10 К_м.

в) Из двух видов бактерий выделили фермент, катализирующий реакцию X ⇄ Y. Ферменты имеют одинаковые значения Vm_ах, но разные значения К_м по отношению к субстрату X. Константа Михаэлиса для фермента А составляет 2,0 мкМ, а для фермента В — 0,5 мкМ. Представленный ниже график иллюстрирует ход реакции под действием ферментов, взятых в одинаковых концентрациях, при [X] = 1 мкМ. Какая кривая какому ферменту соответствует?

9. Применение уравнения Михаэлиса-Ментен (I).

В лаборатории открыта новая версия фермента веселазы, которую назвали веселаза*; фермент катализирует следующую реакцию:

грусть ⇄ веселье

Начато изучение свойств фермента.

а) В первом эксперименте при [Е_t] = 4 нМ найдено значение максимальной скорости V_mах = 1,6 мкМ с Зная это, определите константу rat для веселазы* (в соответствующих единицах измерения).

б) Во втором эксперименте при [Е_t] = 1 нМ и [веселье] = 30 мкМ было найдено значение начальной скорости реакции v₀ ⁼ 300 нМ с^-1. Каково измеряемое значение К_м для веселазы* для субстрата веселье (в соответствующих единицах измерения)?

в) Дальнейшие исследования показали, что очищенная веселаза*, использовавшаяся в двух первых экспериментах, на самом деле содержала примесь обратимого ингибитора, называемого злость. Примесь злости была тщательно удалена из образца фермента, а два эксперимента провели вновь; измеренное в условиях эксперимента (а) значение V_mах составило 4,8 мкМ с^-1, а измеренное в условиях эксперимента (б) значение К_м оказалось равным 15 мкМ. Рассчитайте параметры а и а' для ингибитора ЗЛОСТЬ.

г) Исходя из представленной выше информации, определите, к какому типу ингибиторов относится злость.

10. Применение уравнения Михаэлиса-Ментен (II).

Найден фермент, катализирующий реакцию

А ⇄ В

Для этого фермента значение константы Михаэлиса К_м для субстрата А было равно 4 мкМ, а r_cat составила 20 мин^-1.

а) В одном эксперименте при концентрации [А] = 6 мМ начальная скорость реакции v0 составила 480 нМ мин^-1. Какой была концентрация фермента [E_t] в этом эксперименте?

б) В следующем эксперименте при концентрации [Е_t] = 0,5 М значение начальной скорости составило 5 мкМ мин^-1. Какой была концентрация субстрата [А] в этом эксперименте?

в) Обнаружено, что вещество Z является очень сильным конкурентным ингибитором данного фермента с α = 10. В эксперименте с той же концентрацией фермента [Е_t], как в вопросе (а), но при другой концентрации [А] был добавлен ингибитор Z, что привело к снижению скорости v₀ до 240 нМ мин^-1. Какова концентрация [А] в этом эксперименте?

г) Основываясь на кинетических параметрах, приведенных выше, скажите, достигает ли этот фермент «каталитического совершенства»? Кратко объясните свой ответ, используя кинетический(е) параметр(ы), чтобы определить «каталитическое совершенство».

11. Оценка V_mах и К_м по экспериментальным данным.

Хотя существуют методы точного определения V_mах и К_м (доп. 6-1), иногда эти параметры можно быстро оценить, просто наблюдая за значением начальных скоростей реакции при разных концентрациях субстрата. Оцените Vm_ах и К_м ферментативной реакции на основании приведенных в таблице данных.

12. Свойства фермента, участвующего в синтезе простагландинов.

Простагландины — это класс эйкозаноидов, т. е. производных жирных кислот, оказывающих чрезвычайно сильное влияние на ткани позвоночных животных. Простагландины (ПГ) связаны с возникновением лихорадки и воспаления, а также с сопутствующими им болевыми ощущениями. Простагландины образуются из 20-углеродной жирной кислоты, называемой арахидоновой кислотой, в результате реакции, которую катализирует фермент простагландин-эндопероксид-синтаза. Этот фермент из класса циклооксигеназ использует кислород для превращения арахидоновой кислоты в ПГ являющийся непосредственным предшественником многих различных простагландинов (синтез простагландинов обсуждается в гл. 21).

а) Ниже представлены кинетические данные для реакции, катализируемой простагландин- эндопероксид-синтазой. Обращая внимание на первые две колонки, определите V_mахи К_м для данного фермента.

б) Ибупрофен является ингибитором простагландин-эндопероксид-синтазы. Путем ингибирования синтеза ПГ ибупрофен снижает воспаление и боль. Используя данные первой и третьей колонок, определите тип ингибирования ибупрофеном реакции, катализируемой простагландин-эндопероксид-синтазой.

13. Графический анализ V_mах и К_м.

Представленные ниже экспериментальные данные получены при изучении ферментативной активности кишечной пептидазы с глицилглицином в качестве субстрата.

Глицилглицин + Н₂O —> 2 глицин

С помощью графического анализа (доп. 6-1 и динамические графики) определите Vm_ах и К_м для данных фермента и субстрата.

14. Уравнение Иди-Хофсти.

Одним из возможных преобразований уравнения Михаэ- лиса-Ментен является уравнение Лайнуи- вера-Берка. Умножая обе части уравнения Лайнуивера-Берка на Vm_ах и осуществляя перестановку, получаем уравнение Иди- Хофсти:

Ниже представлен график зависимости v₀, от v₀ / [S] для ферментативной реакции. Синяя кривая была получена без ингибитора. Какая кривая (А, В или С) получена в присутствии конкурентного ингибитора? Подсказка: см. уравнение 6-30.

15. Число оборотов карбоангидразы.

Карбоангидраза эритроцитов (Мr = 30 000) — один из наиболее активных из известных на сегодняшний день ферментов. Она катализирует обратимую гидратацию СO₂.

Н₂O + СO₂ ⇄ Н₂СO₃

Данная реакция играет важную роль в транспорте СO₂ от тканей к легким. Каково число оборотов карбоангидразы (в едипицах/мин), если за 1 мин при 37 °С 10 мкг чистого фермента катализируют гидратацию 0,3 г СO₂?

16. Уравнение скорости реакции при конкурентном ингибировании.

Уравнение скорости реакции при конкурентном ингибировании выглядит следующим образом:

Выведите это уравнение, пользуясь уравнением для общей концентрации фермента [Е]_общ = [Е] + [ЕI] + [ЕS], а также определениями α и К1, данными в тексте. Действуйте по аналогии с выводом уравнения Михаэлиса-Ментен.

17. Необратимое ингибирование фермента.

Многие ферменты подвергаются необратимому ингибированию ионами тяжелых металлов, такими как Hg²⁺, Сu²⁺ или Ag⁺, вступающими в реакцию с важными сульфгидрильными группами с образованием меркаптидов:

Е-SН + Ag⁺ —> Е-S-Ag + Н⁺

Сродство ионов Ag⁺ к сульфгидрильной группе настолько велико, что эти ионы можно использовать для количественного титрования SН-групп. К 10 мл раствора, содержащего 1 мг/мл чистого фермента, добавили ровно столько АgNO₃, сколько нужно для полной инактивации фермента. Для этого понадобилось 0,432 мкмоль AgNO₃. Рассчитайте минимальную молекулярную массу фермента. Почему полученное таким путем значение молекулярной массы будет минимальным?

18. Клиническое применение избирательного ингибирования ферментов.

В сыворотке крови человека содержатся ферменты, называемые кислыми фосфатазами, которые гидролизуют эфиры фосфорной кислоты в слабо кислой среде (pH 5,0):

Кислые фосфатазы синтезируются в эритроцитах, печени, селезенке и предстательной железе. Фермент из предстательной железы имеет важное клиническое значение, поскольку повышение его активности в крови может быть признаком возникновения рака простаты. Фосфатаза из предстательной железы сильно ингибируется тартрат-ионами, тогда как кислые фосфатазы из других тканей ими не ингибируются. Как можно использовать эти данные дня разработки метода специфического определения активности кислой фосфатазы из предстательной железы в сыворотке крови человека?

19. Ингибирование карбоангидразы ацетазоламидом.

Карбоангидраза сильно ингибируется лекарственным препаратом ацетазоламидом, которое применяют в качестве мочегонного средства и при глаукоме для снижения глазного давления (повышение которого связано с избыточным накоплением внутриглазной жидкости). Карбоангидраза играет важную роль в этих и других секреторных процессах, поскольку она участвует в регуляции уровня pH и содержания бикорбоната во многих жидкостях организма. Верхняя кривая на рисунке отражает зависимость начальной скорости реакции (в процентах от V_mах), катализируемой карбоангидразой, от концентрации субстрата. Нижняя кривая была построена при проведении эксперимента в присутствии ацетазоламида. Исходя из анализа кривых и ваших знаний о кинетических свойствах конкурентных и смешанных ингибиторов, определите природу ингибирования ацетазоламидом. Объясните ход своих рассуждений.

20. Действие обратимых ингибиторов.

Выведите уравнение, описывающее влияние обратимого ингибитора на кажущееся значение К_м (К_{м. каж} = αК_м/α′). Исходите из уравнения 6-30 и того факта, что /С_{м, каж} равно концентрации субстрата, при которой v₀ = V_max/2a'.

21. Оптимум pH для действия лизоцима.

В активном центре лизоцима расположены два аминокислотных остатка, играющих основную роль в катализе: Glu³⁵и Asp⁵². Значения рК_a карбоксильных групп боковых цепей этих остатков равны соответственно 5,9 и 4,5. В каком состоянии ионизации (протонированном или депротонированном) находится каждый из этих остатков при оптимальном значении pH для лизоцима (5,2)? Как состояние ионизации этих остатков может объяснить приведенная на рисунке рН- зависимость активности лизоцима?

22. Учимся решать кинетические задачи (обратитесь к динамическим графикам для гл. 6).

а) Используя динамический график для уравнения 6-9, изобразите зависимость скорости реакции от [S]. Используйте значения V_mах = 100 мкМ • с^-1 и К_м = 10 мкМ. Как сильно возрастает v₀ при удвоении значения [S] от 0,2 до 0,4 мкМ? Чему равно v₀ при [S] = 10 мкМ? Как увеличится v₀ при увеличении [S] от 100 до 200 мкМ? Обратите внимание на изменение вида графика при двукратном увеличении или уменьшении значений V_max или К_м.

б) Используя динамический график для уравнения 6-9 и кинетические параметры из задания а), постройте зависимость для случая α = α' = 1. Посмотрите, что произойдет с графиком при α = 2; α' = 3; α = 2 и α' = 3.

в) Используя динамический график для уравнения 6-9 и уравнение Лайнуивера-Берка в доп. 6-1, постройте зависимость в координатах Лайнуивера-Берка для всех случаев, перечисленных в заданиях (а) и (б). Влево или вправо смещается отрезок, отсекаемый графиком на оси х, при α = 2? Влево или вправо смещается отрезок, отсекаемый графиком на оси х, при α = 2 и α' = 3?

Анализ экспериментальных данных

23. Изучение и изменение свойств лактатдегидрогеназы.

Изучение структуры белков привело к возникновению гипотезы о связи аминокислотного состава ферментов и их функции. Один из путей проверки этой гипотезы состоит в использовании технологии рекомбинантных ДНК для создания мутантных версий фермента и изучении структуры и функций измененных форм. Технология, использующаяся для реализации такого подхода, обсуждается в гл. 9.

Одним из примеров такого рода исследований может служить работа Кларка с сотрудниками по изучению фермента лактатдегидрогеназы, опубликованная в 1989 г. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует восстановление пирувата до лактата при участии NADН (см. разд. 14.3). На рисунке схематично изображен активный центр фермента с молекулой пирувата посредине:

Механизм реакции аналогичен механизмам многих реакций, протекающих с участием NADН (рис. 13-24); происходит реакция, практически обратная той, что изображена на стадиях 2 и 3 на рис. 14-7. В переходном состоянии карбонильная группа молекулы пирувата сильно поляризована:

а) Мутантная форма ЛДГ, в которой остаток Argios заменен на Gln, обладает лишь 5% связывающей способности фермента дикого типа по отношению к пирувату и 0,07% его активности. Как бы вы объяснили это наблюдение?

б) Мутантная форма ЛДГ, в которой остаток Arg¹⁷¹ заменен на Lys, обладает 0,05% способности фермента дикого типа связывать субстрат. Почему это изменение оказалось неожиданным?

в) В кристаллической структуре ЛДГ гуанидиновая группа Arg¹⁷¹и карбоксильная группа пирувата расположены таким образом, как показано в копланарной конфигура-

ции типа «вилки». Зная это, дайте объяснение того колоссального изменения свойств фермента, которое происходит при замене Arg¹⁷¹ на Lys.

г) Мутантная форма ЛДГ, в которой остаток Ilе²⁵⁰ заменен на Gln, слабее связывает NADH. Объясните этот результат.

Кларк с коллегами также предприняли попытку создать мутантную версию фермента, которая бы связывала и восстанавливала не пируват, а оксалоацетат. Они сделали единственную замену: заменили Gln¹⁰² на Arg; получившийся фермент должен восстанавливать оксалоацетат до малата, но не должен больше восстанавливать пируват до лактата. Таким образом, они превратили ЛДГ в малатдегидрогеназу.

д) Изобразите схематично структуру активного центра мутантной ЛДГ со связанным оксалоацетатом.

е) Объясните, почему мутантный фермент «предпочитает» оксалоацетат пирувату.

ж) Таким образом, замена более крупной аминокислоты в активном центре фермента позволила связываться более крупному субстрату. Объясните этот результат.