Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 1 - Д. Мецлер 1980

Молекулы, из которых мы состоим
Как мы изучаем структуру молекул
Анализ продуктов

Практически в любом биохимическом исследовании очень важно уметь обнаруживать и точно определять ничтожные количества специфических соединений. Чаще всего для этого используют особые реагенты — индикаторы, которые при взаимодействии со специфическими соединениями определенным образом окрашиваются. Например, для выявления на хроматограмме аминокислот или пептидов, присутствующих в очень малых количествах (доли микромоля), хроматограмму опрыскивают ингидрином (дополнение 8-Е). Если выявляемое соединение находится в растворе, то по интенсивности окрашивания можно определить его количество. Фенолы и концентрированная серная кислота окрашивают сахара (в растворе или на хроматографической бумаге) в красный цвет. Эта реакция лежит в основе колориметрического анализа углеводов. Восстанавливающие сахара выявляют на хроматограммах, опрыскивая последние раствором нитрата серебра.

Нуклеотиды, как и многие другие поглощающие свет соединения, определяют количественно по их спектрам поглощения (рис. 13-11 и 13-12) [146]. Еще более чувствительным методом является флуоресцентный анализ. Например, он позволяет обнаружить на тонкослойной хроматограмме рибофлавин в количестве 3 пикомоль (1 нг) (рис. 2-34) [147]. Один из новых реагентов, флуорескамин, взаимодействует с любым первичным амином, образуя интенсивно флуоресцирующие продукты. С его помощью можно обнаружить очень малые количества аминокислот — менее 50 пикомолей (рис. 2-36) [148].

Чрезвычайно чувствительны методы обнаружения летучих соединений с помощью газовой хроматографии. Применяя пламенные ионизационные детекторы, можно определить содержание практически любого соединения в количестве, не превышающем несколько пикомолей. Вряд ли стоит говорить, насколько важна разработка новых, еще более чувствительных методов. Применение наиболее чувствительных из них (в частности, масс-спектрометрии) позволяет теперь в некоторых случаях обнаружить вещество, когда его содержание не превышает нескольких фемтомолей! Анализ выхода нейромедиаторов из одиночных нейронов мозга может иметь принципиальное значение для понимания работы нервных клеток, точно так же как анализ содержимого отдельных клеток может оказаться весьма полезным для выяснения многих вопросов биохимии высших организмов.

Весьма ценной разновидностью обычной тонкослойной или бумажной хроматографии является диагональная хроматография. Сначала нанесенный материал хроматографируют в одном направлении, затем в тонком слое на пластинке или бумаге проводят определенную химическую реакцию, после чего осуществляют разделение в другом направлении. Немодифицированные соединения располагаются по диагонали пластинки, тогда как продукты реакции оказываются смещенными по отношению к ней. Этим методом исследовали фотохимические [149] и другие [147] реакции флавинов. Аналогичный диагональный электрофорез применялся для идентификации пар —SH-групп, образующих в белках дисульфидные мостики [150]. Пептидные фрагменты, содержащие S—S-мостики, разделяли с помощью электрофореза на бумаге, затем обрабатывали бумагу парами надмуравьиной кислоты, разрывающей мостики [уравнение (2-20)], и после электрофореза в перпендикулярном направлении опрыскивали бумагу нингидрином. Пятна, расположенные вне диагонали, соответствовали фрагментам, которые участвовали в образовании S—S-мостиков. По положению пятен подбирали пары, которые далее сопоставляли с пептидами, охарактеризованными в ходе стандартных операций установления последовательности — операций, проводившихся на белке, окисленном надмуравьиной кислотой.