Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 2 - Д. Мецлер 1980
Коферменты - особые природные специализированные реагенты
Тиаминдифосфат
Механизм а-расщепления
Идя по пути, намеченному Мицухара, Р. Бреслоу исследовал ту же реакцию с использованием тогда еще нового метода ЯМР. Он сделал удивительное открытие: атом водорода в положении 2 тиазолиевого цикла (между серой и азотом) легко обменивается на дейтерий из 2Н2О. (Теперь установлено, что рКа этого протона равно приблизительно 12,7 [21].) Бреслоу предположил, что биполярный ион (или илид) тиазолия, образующийся в результате отщепления протона [уравнение (8-13), стадия а], является ключевым промежуточным продуктом в реакциях, катализируемых ферментами, зависимыми от тиамина [уравнение (8-13)]. Правильность этого предположения в настоящее время общепризнана, Анионный центр биполярного иона, который стабилизирован соседним положительным зарядом атома азота, может реагировать с субстратом, таким, как а-кетокислота или а-кетоспирт (а-кетол), присоединяясь по карбонильной группе [стадия б или б' в уравнении (8-13)] [22, 23].
Аддукты, образующиеся на стадиях б и б' [уравнение (8-13)], легко могут претерпевать ß-расщепление, как отмечено стрелками, показывающими движение электронов в направлении K=N+-гpyппe. Под формулами аддуктов в уравнении (8-13) приведены формулы ß-кето-кислоты и ß-кетола; стрелками на этих формулах показано перемещение электронов при декарбоксилировании и при альдольном расщеплении. Сходство этих процессов с зависимой от тиамина реакцией расщепления оказывается особенно разительным, если вспомнить, что в некоторых реакциях, катализируемых альдолазами и декарбоксилазами, карбонильная группа субстрата перед расщеплением связи превращается в протонированное по N-атому шиффово основание.
Мы видим, что сущность действия тиаминдифосфата как кофермента заключается в том, что он переводит субстрат в форму, в которой может происходить перемещение электронов от расщепляемой связи к структурным элементам кофермента. Вследствие этого изменения структуры легко происходит реакция разрыва связи, которая в противном случае была бы невозможной. Для завершения каталитического цикла необходимо повторное обращение потока электронов. Присоединенный к тиамину продукт расщепления любого из аддуктов, представленных в уравнении (8-13), может снова превратиться в биполярный тиазолий-ион и альдегид [уравнение (8-14)].
В чем состоит роль пиримидиновой части кофермента в этих реакциях? Часто высказывается предположение, что — NН2-группа пиримидина находится в положении, подходящем для осуществления функции основного катализатора при образовании биполярного тиазолий-иона. Рентгеноструктурные исследования показывают, что в кристаллических соединениях тиамина взаимная ориентация двух колец1) благоприятна для выполнения этой функции [25]. Однако аминогруппа тиамина не является сильно основной; в действительности центром протонирования при низких значениях pH (с рKа≈4,8) служит в основном атом N-1 пирамидинового кольца (рис. 8-2). В протонированной форме основность —NН2-группы выражена еще слабее вследствие оттягивания электронов к кольцу. Таким образом, фермент может изменять основность —NН2-группы на разных стадиях реакции, влияя на протонирование кольца. Одна весьма умозрительная идея состоит в том, что фермент может стабилизировать минорный таутомер аминопиримидинового кольца. Совместно с нуклеофильной группой он мог бы составить «систему переноса заряда», аналогичную описанной для химотрипсина (рис. 7-2). Ниже схематически представлена гипотетическая система «переноса заряда», посредством которой аминопиримидиновое кольцо тиамина могло бы способствовать удалению 2'-протона тиазолиевого кольца:
Пиримидиновое кольцо оказывает также большое влияние на основность тиазолиевого азота и может контролировать степень диссоциации C-2-протона [26].
Ферменты, зависимые от тиамина, как правило, нуждаются в двухвалентном металле, например Mg2+ или Мn2+; можно полагать, что главным центром связывания иона металла является пирофосфатная группа [27].
1) Однако в кристаллах 2-а-оксиэтилтиамина — промежуточного соединения в катализируемом тиамином распаде пирувата до ацетальдегида — ориентация носит несколько иной характер [24].