Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 2 - Д. Мецлер 1980
Ферменты: белковые катализаторы клеток
Основы ферментативной кинетики
Образование и превращение комплекса ES
Ферменты не могут действовать на расстоянии2), поэтому первой стадией ферментативной реакции должно быть образование комплекса ES:
Процесс этот обратим: комплекс ES в свою очередь превращается (обычно по типу унимолекулярной реакции) в продукт или продукты. Если реакция (6-14) в целом необратима, то для описания подобной системы необходимы три константы скорости. Описание кинетических свойств системы в общем случае является довольно сложной задачей, однако в подавляющем числе экспериментов концентрация фермента исключительно низка (порядка 10-8 М), в то время как субстрат присутствует в большом избытке1). При этих условиях в большинстве ситуаций, представляющих интерес для биохимии, справедливо допущение о стационарном протекании процесса. Предполагается, что образование комплекса ES из свободного фермента и субстрата точно уравновешивается превращением ES в Р; это означает, что на протяжении относительно небольшого интервала времени, необходимого для экспериментального определения скорости, концентрация ES остается практически постоянной. В действительности допущение о стационарности является сильным упрощением. Как указывал Дженкс [12], стационарный режим реализуется лишь в том случае, когда абсолютная скорость изменения концентрации промежуточного соединения пренебрежимо мала по сравнению со скоростями изменения концентраций реагентов и продуктов.
2) Еще совсем недавно химики полагали, что фермент и субстрат могут взаимодействовать, будучи на расстоянии 10 нм и более. Подумайте, какого типа эксперименты можно провести, чтобы опровергнуть подобную гипотезу.
Зависимость начальной скорости катализируемой ферментом реакции превращения одного субстрата от концентрации последнего описывается уравнением Михаэлиса — Ментен
где КМ = (k2+k3)/k12). Это уравнение можно вывести, приравняв скорость образования комплекса ES (т. е. величину k1 [Е]|[S]) к скорости его диссоциации (к величине (k2+k3) [ES]). В этом случае
Используя это уравнение и уравнение материального баланса для фермента, из которого следует, что [Е] = [Е]t—[ES], получаем следующее выражение для доли фермента, находящегося в виде фермент-субстратного комплекса:
Максимальная скорость Vmах = k3[Е]t достигается только в том случае, когда весь фермент переведен в форму ES. При остальных условиях v = k3 [ES] и выполняется соотношение
Подставляя выражение для [ES]/[E]tв уравнение (6-17), приходим к уравнению Михаэлиса — Ментен (6-15).
Уравнение (6-15) связывает скорость, наблюдаемую при данной концентрации субстрата, с максимальной скоростью, которая имела бы место, если бы концентрация субстрата была бесконечно высока. Величины Vmax и КM часто используют как кинетические параметры фермента, и их определение является важной составной частью описания свойств любого фермента.
Во многих случаях скорость обратного превращения комплекса ES в свободные фермент и субстрат намного превышает скорость превращения ES в продукты (k2≫k3). Тогда константа КM равна отношению » k2/k1, т. е. константе диссоциации комплекса ES на свободные фермент и субстрат. Таким образом, иногда константа КM обратно пропорциональна прочности связывания субстрата ферментом. В таких случаях обратное значение КМ является мерой сродства субстрата к субстрат связывающему центру фермента. Величина 1/КM может быть использована и для характеристики ряда разных субстратов, превращаемых, одним н тем же ферментом: субстраты, связывающиеся более прочно имеют более низкие значения КM. Следует, однако, иметь в виду, что условие k3≪k2 может выполняться для одних (более плохих) субстратов и совсем не выполняться для других.
1) В клетках, однако, соотношение между концентрациями фермента и субстрата может быть обратным [11].
2) Параметр КМ называют константой Михаэлиса. — Прим. перев.
РИС. 6-2. График зависимости скорости реакции v от концентрации субстрата [S] для простого ферментативного процесса.
На рис. 6-2 изображена теоретическая зависимость скорости реакции от концентрации субстрата, описываемая уравнением (6-15). На осю ординат отмечено положение максимальной скорости (Vmах), однако совершенно ясно, что, за исключением тех случаев, когда величина КМ. чрезвычайно мала, экспериментально наблюдаемая скорость (v) никогда не может достичь значения Vmax, а лишь асимптотически приближается к нему. Из рис. 6-2 можно определить КM она равна значению [S], при котором v = Vmax/2. Следует отметить, что из-за трудности определения величины Vmах график, представленный на рис. 6-2, используется довольно редко. Однако он очень нагляден и с появлением методов оценки параметров Vmах и КМ с помощью ЭВМ вновь начинает применяться. Отметим также, что кривая, представленная на рис. 6-2, совпадает по форме с кривыми насыщения для случая обратимого связывания (рис. 4-1).