Молекулярная биология: Структура и функции белков - Степанов В.М. 2005

Третичная структура белка
О соотношении между первичной и пространственной структурами белка

Положение о том, что последовательность аминокислотных остатков полипептидной цепи белка несет в себе всю информацию, необходимую и достаточную для формирования однозначной пространственной структуры, относится к числу фундаментальных принципов молекулярной биологии. Границы приложимости этого принципа и некоторые особенности его реализации требуют комментариев.

Прежде всего этот принцип еще не означает, что любая случайно заданная последовательность аминокислот обязательно даст устойчивую компактную структуру — ведь богатый экспериментальный материал, который обобщен в этом положении, относится к эволюционно отобранным первичным структурам, а не к случайным последовательностям аминокислотных остатков. Пока, видимо, трудно дать решение этой проблемы в общем виде, она все еще остается дискуссионной. Распространено мнение, что однозначное соотношение между последовательностью аминокислот и пространственной структурой является уникальным свойством относительно небольшой доли всех возможных первичных структур — именно тех, которые были отобраны в ходе эволюции белков.

Согласно иной точке зрения, круг последовательностей, способных к свертыванию в компактную глобулу, гораздо шире. Очевидно лишь, что таким свойством обладает далеко не любая последовательность аминокислот. Так, фрагмент 1—126 нуклеазы стафилококков (белка, содержащего 149 аминокислотных остатков в пептидной цепи) не образует сколько-нибудь устойчивой пространственной структуры, хотя по размеру он вполне сравним с множеством небольших белков. Панкреатическая рибонуклеаза (содержит 124 аминокислотных остатка в полипептидной цепи) после отщепления четырех остатков с карбоксильного конца утрачивает способность к ренатурации. По-видимому, не является компактным, хотя и содержит элементы вторичной структуры, ß-казеин. Известно немало мутантов природных белков, в которых одна аминокислотная замена полностью дестабилизирует структуру. Следовательно, существуют полипептидные цепи, неспособные в обычных условиях свернуться в компактную однозначную пространственную структуру.

Однако тенденция к образованию более или менее компактной, пусть еще несовершенной пространственной структуры присуща, по-видимому, достаточно широкому набору последовательностей аминокислот.

В то же время нет полной уверенности, что данной последовательности аминокислот обязательно соответствует одна и только одна пространственная структура, единственный минимум свободной энергии. Иными словами, вопрос сводится к возможности существования двух (или более) альтернативных пространственных структур для одной и той же последовательности аминокислот. В большинстве изученных случаев ренатурация приводит к восстановлению нативной структуры белка; имеются лишь указания на возможность образования третичной структуры, отличающейся от нативной, при ренатурации яичного альбумина. Если последний факт и верен, то он выглядит исключением.

Учитывая это, следует полагать, что для полипептидных цепей существующих в природе белков соответствие первичная структура — пространственная структура в подавляющем большинстве случаев действительно однозначно. Это, разумеется, не означает, что тот или иной белок не может под воздействием внешних факторов, например образования комплекса с каким-либо лигандом, принимать различные конформации. Такая ситуация вполне реальна, более того, типична. Обсуждается иное: возможно ли, чтобы в одинаковых условиях белок мог образовывать две пространственно различные формы.

Необходимо иметь в виду и еще одну особенность соотношения между первичной и третичной структурами белка. Если данной последовательности аминокислот отвечает, как правило, единственный способ свертывания в пространстве, единственная третичная структура белка, то обратное положение неверно. Данному способу свертывания полипептидной цепи соответствует, как показывает опыт, не одна, а целое семейство последовательностей аминокислот. Иными словами, справедливо соотношение:

семейство первичных структур ↔ пространственная структура

Очевидно, что должны существовать определенные закономерности, правила, своего рода стереохимтеский код, управляющий формированием пространственной структуры из данной последовательности аминокислот. Раскрытие этого кода — важнейшая задача физической химии белка, решение которой еще не достигнуто, несмотря на наличие ряда интересных подходов.

Тем не менее некоторые особенности стереохимического кода могут быть обсуждены. Прежде всего он вырожден, т.е. одной третичной структуре, одному способу укладки пептидной цепи отвечает, как уже отмечалось, набор последовательностей аминокислот. Так, весьма близкую пространственную структуру имеют глобины — содержащие гем белки, связывающие кислород, в том числе гемоглобины и миоглобины различных видов животных, легглобин растений и т.д. Эти пептидные цепи, отличающиеся составом и последовательностью аминокислот, состоят примерно из 140-150 остатков (см. гл. 8).

Поскольку все они дают при свертывании однотипную пространственную укладку полипептидной цепи, отличающуюся лишь в деталях, очевидно, что далеко не все аминокислотные остатки в равной мере ответственны за образование третичной структуры. Такое заключение подтверждается многими экспериментами по направленной замене аминокислотных остатков в отдельных позициях полипептидной цепи методом сайт-специфического мутагенеза. Так, замена остатка Рrо-86 в лизоциме фага Т4 на Gly, Ser, Cys, Leu, Asp, Arg и His влекла за собой небольшие по величине, хотя и простирающиеся иногда на 20 А изменения в структуре. Тем не менее все эти мутантные белки почти не отличались от исходного по температурной стабильности и сохраняли в целом тот. же способ укладки полипептидной цепи в пространстве.

Интересно, что гораздо значительнее изменилась их ферментативная активность, несмотря на то что точка замены отстоит на 24 А от каталитического центра. Впрочем, нередки и такие случаи, когда замена единственного остатка резко влияет на стабильность белка. Показано, например, что замена в аденилаткиназе E.coli Ser-87 на Pro снижает содержание а-спиралей с 50 до 39% и делает структуру белка неустойчивой при 40°С, что приводит in vivo к глубокому протеолитическому расщеплению и полной утрате фермента.

Можно было бы думать, что существует определенное число аминокислотных остатков, которые решающим образом влияют на образование пространственной структуры. Однако число инвариантных остатков, т.е. аминокислот, неизменно занимающих одно и то же положение в полипептидных цепях достаточно многочисленного семейства эволюционно родственных белков обычно невелико, подчас 20-30% или значительно меньше. Так, в белках оболочки вирусов растений, близких вирусу мозаики табака, из 158 остатков инвариантны 25 (16%), а в семействе карбоксипептидаз, включающем ферменты животных и некоторых микроорганизмов, примерно из 310 аминокислотных остатков — только 42 (13%). В семействе глобинов инвариантных остатков удивительно мало — всего шесть. Было бы чрезвычайно трудно представить себе, чтобы весь набор элементов вторичной структуры (в глобинах это а-спирали), а также все способы их укладки в третичную структуру могли диктоваться столь малым числом инвариантных аминокислотных остатков даже с учетом довольно крупной инвариантной структуры — гема.

Таким образом, следует искать какие-то другие общие черты в семействах первичных структур белков. Достаточно устойчивым признаком оказывается распределение по последовательности гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остатков. В особенности важно непременное наличие в определенных позициях гидрофобных аминокислот (инвариантно гидрофобных остатков).

Например, в гемоглобинах млекопитающих 33 позиции в первичной структуре всегда заняты гидрофобными аминокислотами — инвариантно гидрофобны. Столь высокая значимость инвариантных гидрофобных остатков в первом приближении понятна — почти все они необходимы для формирования гидрофобного ядра. Гидрофобные остатки важны для организации контактов между элементами вторичной структуры при свертывании. Наконец, характерное распределение гидрофобных и гидрофильных остатков нужно для воспроизведения элементов вторичной структуры.

Разумеется, инвариантными гидрофобными остатками не исчерпываются те характерные черты, которыми определяется формирование пространственной структуры данной последовательностью аминокислот. По-видимому, существенно сохранение последовательностей определенного типа, задающих повороты пептидной цепи. Часто инвариантны остатки глицина, включение которых придает цепи гибкость, снимая многие ограничения на набор углов φ и ψ. Наконец, инвариантны и те аминокислотные остатки, которые, возможно, не участвуя в формировании пространственной структуры, незаменимы для характерной функции белка, например входят в его активный центр.

Удивительно, что в некоторых случаях для образования правильной пространственной структуры не обязательна целостность собственно полипептидной цепи. Так, продукт ограниченного протеолиза панкреатической рибонуклеазы субтилизином — рибонуклеаза S — содержит один разрыв полипептидной цепи после А1а-20. Пептидный фрагмент 1-20 может быть отделен от остаточного белка (21-124), однако при смешении они вновь формируют активную рибонуклеазу S, третичная структура которой лишь в точке разрыва цепи отличается от строения исходной рибонуклеазы.

Та же панкреатическая рибонуклеаза, в полипептидной цепи которой содержится 124 аминокислотных остатка, после отщепления четырех аминокислот с карбоксильного конца утрачивает способность к свертыванию. Дисульфидные связи при окислении предварительно восстановленного фрагмента 1-120 образуются неправильно, не в том порядке, который характерен нативному белку. Однако в присутствии С-концевого пептида 105-124 происходит регенерация структуры и активности фермента. Для нуклеазы стафилококков (149 аминокислотных остатков) показано, что при смешивании фрагментов 1-126 и 49-149 их взаимодополняющие участки, например 1-48 и 49-149, образуют глобулу, а оставшийся лишним фрагмент 49-126 не входит в компактную структуру и может быть отщеплен трипсином, если ренатурированный фермент стабилизирован присутствием аналога субстрата.

Ренатурация белка из двух фрагментов, иногда перекрывающихся, может быть, видимо, объяснена тем, что соответствующие участки первичной структуры способны, каждый сам по себе, образовывать элементы «мерцающей» вторичной структуры, которые при взаимодействии фрагментов быстро находят путь к закреплению уже значительно более стабильной пространственной структуры. Разумеется, нельзя считать, что ренатурировать, образуя единую третичную структуру, могут фрагменты, полученные каким угодно способом, — разрыв цепи должен происходить на разрешенном участке, выбранном так, чтобы фрагменты могли с известной вероятностью автономно формировать элементы вторичной и, возможно, третичной структуры. Ренатурация белка из крупных фрагментов пептидной цепи, видимо, близка комплементации — восстановлению активности белка при смешивании двух неактивных полипептидных цепей, несущих мутации в разных сайтах.

Итак, код, определяющий однозначность соотношения между способом укладки полипептидной цепи в пространстве (третичной структурой) и целым семейством аминокислотных последовательностей, несомненно, вырожден. Однако меру этой вырожденности не следует переоценивать, поскольку речь идет об устойчивости важной, но не исчерпывающей специфику белка характеристики — способа свертывания полипептидной цепи в пространстве. Эта устойчивость позволяет, пользуясь одной и той же третичной структурой, иметь множество пространственных структур, отличающихся распределением функциональных групп на поверхности белка и, значит, имеющих различные функциональные возможности. Заметим, что однотипность способа пространственной укладки пептидных цепей, принадлежащих одному семейству, не означает идентичности — возможны отличия в деталях, которые опять-таки могут оказаться функционально значимыми.

Сказанное иллюстрируют данные по мутантам хорошо изученного белка — лизоцима. У птиц отряда Galliformes в структуре лизоцимов яичного белка содержится неподалеку от активного центра кластер, который образован одним из двух наборов аминокислотных остатков:

или

В этих позициях другие аминокислотные остатки не встречаются, более того, неизвестны и природные лизоцимы, которые отвечали бы переходным наборам аминокислотных остатков, например Ser-40, Ile-55, Ser-91 и т.п. Полученные методом направленного мутагенеза все возможные переходные формы оказались качественно весьма похожими на оба исходных варианта, в частности обнаруживали близкую удельную активность, Рентгеноструктурный анализ показал, что структура белковой глобулы достаточно пластична и может адаптировать небольшие изменения в строении боковых цепей. Так, при замене Ser-91 на Thr дополнительная метальная группа треонина частью заполняет имевшуюся в структуре «пустоту», частью использует пространство, высвобождающееся после вызванного этой заменой поворота боковой группы Ilе-55 вокруг связи С_а—С_ß. Вместе с тем такие обобщенные характеристики устойчивости белковой глобулы, как температура тепловой денатурации или температурная стабильность активности, у переходных форм, как правило, не оказываются промежуточными, а выходят за пределы этих же характеристик у исходных ферментов. Таким образом, не вызывая драматических изменений в свойствах, замены аминокислот в указанных позициях не безразличны для функциональных свойств фермента и не могут рассматриваться как вполне «нейтральные».

Меру вырожденности стереохимического кода, связывающего первичную и третичную структуру белка, позволяют оценить опыты М. Пташне и сотрудников. Методами белковой инженерии был проведен обмен а-спиралями, узнающими ДНК, между двумя белками-репрессорами: его и 434. Ниже сравниваются фрагменты, кодирующие гомологичные а-спиральные участки в этих белках:

Замена указанного участка в репрессоре 434 на последовательность сrо-репрессора дала устойчивый гибридный белок — репрессор*, функционально похожий на сrо-peпрессор. Таким образом, вполне удалась пересадка большого фрагмента — а-спирали — в структурно родственный, но далеко не идентичный белок, где эта а-спираль смогла, очевидно, установить нековалентные взаимодействия с оставшейся структурой репрессора 434. Этот результат хорошо подтверждает вырожденность соотношения между третичной и первичной структурами. Однако, казалось бы, симметричная операция — пересадка а-спирального фрагмента репрессора 434 в еrо-репрессор — привела к нестабильному белку, неспособному существовать в клетке. Выяснилось, что остаток лейцина, имеющийся в а-спирали сrо-белка, мешает установлению ее контакта с остаточной структурой белка 434. Лишь после замены одного этого остатка на свойственный репрессору 434 изолейцин структура гибридного белка стабилизировалась, и он получил возможность существовать и функционировать. Эти данные, не отрицая вырожденности стереохимического кода, указывают на ее существенные ограничения.

Несмотря на то что код, определяющий соотношение между первичной и третичной структурами белка, не расшифрован, делаются попытки предсказания пространственной структуры белка по известной первичной структуре, а также решения обратной задачи — подбора такой последовательности аминокислот, которая обеспечивала бы формирование третичной структуры заданного типа. Такое решение получено пока для относительно простых структур. Удалось сконструировать аминокислотные последовательности, не существующие в природе и не являющиеся близкими аналогами природных, которые тем не менее способны формировать компактную пространственную структуру заранее заданного типа. Иными словами, сделаны первые шаги к синтезу белков de novo.

Один из таких белков представляет собой пучок из четырех а-спиралей, соединенных петлями. По такому же типу образована пространственная структура природных миогемэритрина и цитохрома с'. Последовательность а-спиральных участков этого белка такова: Gly—Glu—Leu—Glu—Glu—Leu—Leu—Lys—Lys—Leu—Lys— Glu—Leu—Leu—Lys—Gly, а соединяющих их петель —Pro—Arg —Arg—, Распределение же участков вторичной структуры в пептидной цепи следующее: Met-a-спираль—петая—a-спираль—петля—a-спираль—петля—a-спираль—СООН.

Этот белок, ген которого был синтезирован и клонирован в бактериальных клетках, удалось выделить. Показано, что он достаточно устойчив, например, для его развертывания при комнатной температуре требуется 7 М раствор солянокислого гуанидина.

Другой белок, полученный de novo, также представляет собой пучок a-спиралей, образованных последовательностями, содержащими только серин и лейцин. Он способен встраиваться в мембраны и формировать каналы, проводящие катионы через фосфолипидную бислойную мембрану. Таким образом, удалось создать заново структуру, обладающую хотя бы несложной функцией. Описан и синтезирован de novo ß-структурный белок. Делаются попытки создания ферментов de novo.